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1、人DRD1基因启动子区的克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建王春红李哲王明菡邓丽丽王欢［摘要］目的：本研究通过克隆人多巴胺受体(dopaminereceptor,DRD)1基因的启动子区，构建贪有该棊因启动子序列的双荧光素酶报告棊因载体并检测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法：以人静脉血基因组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告棊因质粒pGL3-Basic,构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒PGL3-TK共转染人真
2、核细胞系HEK-2293,同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒PGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度。结果：通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确。与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性。结论：成功构建丫含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告棊因载体，为研宂该棊因的转录调控提供了基础工具。［关键词］多巴胺受体D1基因双荧光素酶报告基因启动子克隆D0l:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.32.25作者单位：110034,辽宁沈
3、阳，沈阳医学院公共卫生学院毒理教研室前言多巴胺作为一种N源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能。多巴胺受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质。多巴胺受体(dopaminereceptor,DRD)为七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前己分离出五种类型(DRD1〜DRD5)。人类DRD五种亚型的棊因位于不同的染色体上。DRD1基因位于第5号染色体短臂37区5带(5p37.5),全长3489bp［1］。人和大鼠的DRD1基因编码产物均为466个氨基酸，其同源性为91%，而跨膜部分的同源性为96%。DRD1受体基因的mRNA在纹状体、伏
4、隔核和嗅结节等部位表达丰富，这些区域中DRD1受体的表达量也非常高［2】。DRD1基因启动子区的多态性位点会通过调控转录活性来影响多巴胺受体1的产量，进而影响多巴胺神经递质的代谢，奋研究发现该基因启动子区的核苷酸多态性位点可能与精神分裂症，双相情感障碍等疾病的发生有关［3-7］。目前，对DRD1基因启动子区的研究其多，但仍未得出一个统一的结论，且很多研宄多局限在对单独某一位点与疾病的冋顾性分析，并未对具体调控做细致的分析。本研究拟通过构建含有DRD1基因启动子区序列的荧光素酶报告基因载体，细胞转染验证其表达活性，为进一步深入研究该基因的转录调控机制提供基础
5、工具。材料与方法人DRD1基因启动子克隆取枸橼酸钠抗凝的人静脉血3ml置于试管中，应用酚-氯仿法提取基因组DNA,所得DNA沉淀加适量的TE(10mol/LTris-HCI,lmol/LEDTApH8.0)溶解，溶解后的DNA于4°C保存。应用Primer5.0软件设计特异性引物，根据pGL3-Basic载体(Promega，美国)多克隆位点选定限制性内切酶(见图1)。划线部分分别为Kpnl和Bgl2的酶切识别位点，引物委托生物公司合成(TaKaRa,大连)。PCR反应条件为：预变性95"C5min；变性95°Clmin,复性60°C30s,延伸72°C2
6、minlOS,循环35次；终末延伸72°C5min。扩增片段长度2001bp(-1990〜+10)。采用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物。紫外光下切胶，并按照GelDNAExtractionKit(TaKaRa)说明书的操作步骤进行纯化。纯化后的PCR产物通过DNAA-TailingKit（TaKaRa）在3’端加一个碱基A后与pGM-T载体（天跟，北京）连接，转化感受态细胞TOP10（天跟），Kpnl和Bgl2（Thermo,美国）双酶切及测序验证插入的片段。验证无误的质粒在双酶切后切胶纯化，与pGL3-Basic载体的连接。使
7、用无内毒素质粒大量提取试剂盒（博迈德，北京）提取重组后的报告基因质粒，内对照质粒PGL3-TK和阴性对照质粒pGL3-Basic。转染HEK293细胞于DMEM/高糖培养基（含10%胎牛血清）（Hyclone,美国）,37°C，5%CO2浓度，100%相对湿度条件下培养。将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic稀释至100ng/μl,内对照质粒pRL-TK稀释至10ng/μl；然后将S组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic与内对照质粒pRL-TK按5:1,10:1,20:1混合。选择对数生长期细胞接种于24孔板（l×105/孔），
8、待细胞生长密度达80-90%，且分布均匀即可进行转染。使用Lipo
