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时间:2020-08-12
《双荧光素酶报告基因检测系统-promega.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、。Dual-LuciferaseReporterAssay试剂准备LuciferaseAssayBufferII10mlLuciferaseAssaySubstrate1vialStop&Glo®Buffer10mlStop&Glo®Substrate,50X200ulPassiveLysisBuffer(PLB),5X30ml1.1XPLB:加1体积的5XPassiveLysisBuffer(PLB)到4体积的dH0中,40C2保存(一个月)。2.LARII:将LuciferaseAssaySubstrate重悬于10mlLuci
2、feraseAssayBufferII中(-200C保存1个月,-700C保存1年)。3.1XStop&Glo试剂:1体积50XStop&Glo®Substrate加入49体积的Stop&Glo®Buffer中(-200C保存15天)。(每次试验需要100ul)细胞处理1.吸除细胞培养液2.1XPBS轻柔的冲洗细胞3.加入1XPLB(推荐用量)4.细胞溶解室温条件下,轻摇细胞15min,-可编辑修改-。-可编辑修改-。瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100,p-401/+100,p-238/
3、+100,p-80/+100,p-25/+100。pGL3-basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(PolifectamineReaent)说明书进行。1.将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk(0.8µg)按1:4混合后为A液,混匀30s,PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液,混匀30s;2.A+B混匀(B加入A)15s,室温下孵育5-10min;3.吸出六孔板中的培养液,用无血清无抗生素的DMEM洗3遍,然后加入AB混合液,每孔
4、0.8mL;4.6h后,加入2mL完全DMEM;5.24h后,倒出旧培养液,换为完全DMEM;6.100µgHO或B(a)P处理lh或24h;(200µMMMS,24h-溶解于MeSO,Sigma);222(HO不引起OGG1升高)227.采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪),所有实验严格平行操作。8.以相对荧光素酶单位(相当于对照组的百分比)表示。结果采用Student-t检验分析各组之间荧光素酶活性的差异。-可编辑修改-。欢迎您的下载,资料仅供参考!致力为
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