双荧光素酶报告基因检测系统-promega.doc

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1、Dual-Luciferase®ReporterAssay试剂准备LuciferaseAssayBufferII10mlLuciferaseAssaySubstrate1vialStop&Glo®Buffer10mlStop&Glo®Substrate,50X200ulPassiveLysisBuffer(PLB),5X30ml1.1XPLB:加1体积的5XPassiveLysisBuffer(PLB)到4体积的dH20中，40C保存（一个月）。2.LARII：将LuciferaseAssaySubstrat

2、e重悬于10mlLuciferaseAssayBufferII中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。3.1XStop&Glo试剂：1体积50XStop&Glo®Substrate加入49体积的Stop&Glo®Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul）细胞处理1.吸除细胞培养液2.1XPBS轻柔的冲洗细胞3.加入1XPLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+10

3、0，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。pGL3-basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(PolifectamineReaent)说明书进行。1.将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk(0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2.A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10min;3.吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的

4、DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4.6h后，加入2mL完全DMEM;5.24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6.100µgH2O2或B(a)P处理lh或24h;（200µMMMS，24h-溶解于Me2SO,Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7.采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。8.以相对荧光素酶单位(相当于对照组的百分比)表示。结果采用Student-t检验分析各组之间荧光素

5、酶活性的差异。