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1、第24卷第1期阜阳师范学院学报(自然科学版)Vol.24,No.12007年3月JournalofFuyangTeachersCollege(NaturalScience)Mar.2007半定量RT-PCR法在检测基因表达水平中的应用1,22王荣,李红菊(1.阜阳师范学院生物系,安徽阜阳236041;2.北京师范大学生命科学学院北京100875)摘要:半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR法)是近年来常用的一种快速、简捷、特异的RNA检测方法,也是探讨基因转录水平的有效手段.该文就半定量RT-P
2、CR法的检测步骤及技术的关键因素(总RNA提取、引物设计、循环数的确定和内参的选择等)进行综述.关键词:半定量RT-PCR;检测;基因表达中图分类号:Q813文献标识码:A文章编号:1004-4329(2007)01-0049-04半定量逆转录多聚酶链式反应(semiquantita-文就半定量RT-PCR方法在基因表达水平中的检tivereversetranscriptionandpoly-merasechainre-测步骤及关键因素作一综述.action,SqRT-PCR)是近年来常用的一种简
3、捷、快1半定量RT-PCR方法的检测步骤速、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,扩增产物以指数形式增1.1提取组织或细胞中的总RNA长,通过测定PCR产物的数量,就可以推测各样品总RNA的纯度和完整性关系到后面的cDNA中特异mRNA的相对含量,即使模板浓度较低也能合成及PCR扩增,因此所提的总RNA要求纯度高,检测到.这就为用非常少量的RNA分析提供了可完整性好并达到一定的浓度.要达到这一要求,必须能.虽然此法只能测定mRNA的相对含量,但在比从取标本开始就
4、进行无RNA酶操作,以防RNA酶较模型组和对照组样品之间特异mRNA的表达差对所提总RNA的降解,具体做法为:所用的器械及异时足以说明问题.器皿必须经200℃以上的高温烘烤最少5h;所用的利用PCR技术对生命过程中某种基因表达量耗材及试剂必须用0.1%的DEPC水处理12～16h,变化的分析经历了一个从相对定量到绝对定量的过这样方可保证所提总RNA的完整;在选用试剂时最程,荧光实时定量PCR仪的问世,使定量技术达到好选用知名品牌公司的试剂,以保证总RNA纯度及了一个新的高度,实现了PCR从定性到定
5、量的飞提取的产量;另外所用的组织量最少应在100mg、细跃,但是,由于荧光实时定量PCR仪价格昂贵,限制胞数最少应在107.了该仪器在研究中的推广使用.事实上,在许多研究1.2总RNA的纯度和完整性鉴定过程中只需评估样品之间某种基因表达水平的相对总RNA提取之后,必须用紫外分光光度计测定差异,半定量RT-PCR技术完全可以满足上述目的其纯度和浓度,A260/A280在1.8～2.0之间方可采[1]的要求.用;然后再用1.5%左右的琼脂糖凝胶对总RNA进与经典的检测基因的表达方法如Northern印
6、行电泳,以鉴定其完整性,浓度不高,完整性不好的迹、RNA酶保护分析等相比,半定量RT-PCR法以标本最好不用,以免影响后面的实验结果.其灵敏度高(比杂交法高1000～10000倍)、专一性1.3cDNA第一链的合成好、快速简便、且对初始总RNA量要求不很严格,不由总RNA逆转录成cDNA时,所取的各组标本需已知浓度的标准品等优点而得到广泛的应用.本的总RNA的量必须要一样多,最好在1g以上,这收稿日期:2007-01-28基金项目:国家自然科学基金项目(30570922)作者简介:王荣(1968
7、),女,实验师,北京师范大学生命科学学院在读研究生.研究方向:分子遗传学.50阜阳师范学院学报(自然科学版)第24卷样才能保证各组标本总RNA中所需检测的mRNARNA量要一样,cDNA量和电泳PCR产物量也要一量的差异.为了使逆转录效益最大,最好采用含有多样,这样才能保证PCR扩增产物能真实反映基因表个碱基的随机序列引物.达的实际情况.1.4PCR扩增2.3引物的选择以逆转录的cDNA第一链为模板,以特异性引PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决物扩增所要检测的mRNA.在PCR扩增时一定要注
8、定的,因此引物的好坏往往是PCR反应成败的关意以下两点:为了克服不同管间扩增引起的“管效键.引物包括扩增目的基因的引物及扩增内参基因益”,必须以组成型表达的内参基因如-actin(或其的引物,引物的设计,要根据基因的非保守序列设它的看家基因,如GAPDH、-MG等)为内标,在同计,以保证扩增的特异性.一管中加入扩增内参基因的引物,共同扩增所要检2.4PCR循环数的确定测的基因和内参基因,内参扩增产物的大小最好与选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖目的基因mRNA扩增产物的
