应用实时荧光定量rt_pcr检测猪hevorf2基因3个连续片段的真核表达水平

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1、中国兽医学报２０１４年１１月第３４卷第１１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＮｏｖ．２０１４Ｖｏｌ．３４Ｎｏ．１１１７０９应用实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测猪ＨＥＶＯＲＦ２基因３个连续片段的真核表达水平＃，赵武＊，秦毅斌，梁家幸，卢冰霞，何颖，段群棚，卢敬专，蒋冬福，周英宁，梁保忠苏乾莲，李斌（广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁５３０００１）摘要：将构建的猪戊型肝炎病毒广西株３个连续ＯＲＦ２基因片段重组真核表达质粒ｐＥＡＳＹ－ＬＢ１、ｐＥＡＳＹ－ＬＢ２、ｐＥＡＳＹ－ＬＢ３转染人肾上皮细胞系２９３Ｔ，应用实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测目的基因ＬＢ１、Ｌ

2、Ｂ２、ＬＢ３。经ＡＢＩ７５００系统建立的标准曲线相关系数（Ｒ２）范围为０．９９４２０９～０．９９９１３０，斜率范围－３．４６９４０３～－３．５７９１０７，扩增效率范围为９０．２８％～９４．１９％。经对转染细胞、空白对照细胞的目的基因、内参基因的扩增曲线和融解曲线分析，表明该实时荧光定量ＰＣＲ扩增体系的特异性良好，通过２－ΔΔＣｔ相对定量法计算，可得出转染细胞２９３Ｔ－ａ、２９３Ｔ－ｂ、２９３Ｔ－ｃ目的基因ＬＢ１、ＬＢ２、ＬＢ３的基因表达量分别为６２２６８３０．８８±８２６４３０．１４、９４４９２３８．６８±９２６０５７．１３、３５１７７９１５．６３±３９

3、４９１７３．４２。本实验室建立的３个重组真核表达质粒在２９３Ｔ细胞中的转染成功为深入研究猪戊型肝炎基因工程疫苗奠定了基础。关键词：猪戊型肝炎；真核表达质粒；转染；实时荧光定量ＰＣＲ中图分类号：Ｓ８５２．６５文献标志码：Ａ文章编号：１００５－４５４５（２０１４）１１－１７０９－０７ＤｅｔｅｃｔｉｎｇｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｓｗｉｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＥｖｉｒｕｓＯＲＦ２ｇｅｎｅｔｈｒｅｅｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｆｒａｇｍｅｎｔｓｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙ，ＬＩＢｉ

4、ｎ＃，ＺＨＡＯＷｕ＊，ＱＩＮＹｉ－ｂｉｎ，ＬＩＡＮＧＪｉａ－ｘｉｎｇ，ＬＵＢｉｎｇ－ｘｉａ，ＨＥＹｉｎｇ，ＤＵＡＮＳＵＱｉａｎ－ｌｉａｎＱｕｎ－ｐｅｎｇ，ＬＵＪｉｎｇ－ｚｈｕａｎ，ＪＩＡＮＧＤｏｎｇ－ｆｕ，ＺＨＯＵＹｉｎｇ－ｎｉｎｇ，ＬＩＡＮＧＢａｏ－ｚｈｏｎｇ（ＧｕａｎｇｘｉＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＶａｃｃｉｎｅｓａｎｄＮｅｗＴｅｃｈｎｏｌｏ－ｇｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ

5、ｓｏｆｐＥＡＳＹ－ＬＢ１，ｐＥＡＳＹ－ＬＢ２，ｐＥＡＳＹ－ＬＢ３ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｎｔｈｒｅｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｏｆＬＢ１，ＬＢ２，ＬＢ３ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｒｏｕｇｈＡＢＩ７５００Ｓｅ－ｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（Ｒ２）ｒａｎｇｅｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ０．９９４２０９ａｎｄ０．９９９１３

6、０．Ｔｈｅｓｌｏｐｅｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｒａｎｇｅｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ－３．４６９４０３ａｎｄ－３．５７９１０７．Ｔｈｅｅｆｆｉ－ｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅＰＣＲｒａｎｇｅｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ９０．２８％ａｎｄ９４．１９％．Ａｎａｌｙｓｉｓｉｎｇｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｌｏｔａｎｄｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅａｎｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｓ，ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａ－－ΔΔＣｔｔｉｖｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｄｇｏｏｄ

7、ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｕｓｉｎｇ２ｒｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙｏｆＬＢ１，ＬＢ２，ＬＢ３ｗｅｒｅ６２２６８３０．８８±８２６４３０．１４，９４４９２３８．６８±９２６０５７．１３，３５１７７９１５．６３±３９４９１７３．４２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｈｒｅｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓｉｎｔｏ２９３Ｔｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｓｗｉｎ

8、ｅｈｅｐａ－ｔｉｔｉｓＥｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖａｃｃｉｎｅ．Ｋｅ