应用真核系统表达猪生长激素基因的研究

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1、中山大学博士学位论文应用真核系统表达猪生长激素基因的研究姓名：欧阳菁申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王珣章;龙綮新2003.6.6应用真核系统表达猪生长激素基因的研究欧阳菁导师：王殉章教授龙綮新教授专业：生物化学与分子生物学摘要生长激素(Somatotropin)是一种具有广泛生理功能的生长调节素．能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖及脂肪的代谢。猪生长激素(Porcinesomato仃opin，pST)是猪体内天然存在的一种能调节其正常生长和肌肉发育的主要激素之一．

2、它不仅能促进葡萄糖的吸收、核酸与蛋白质的合成、脂肪的分解，同时还能增加矿物质的吸收与滞留。给猪注射外源pST可显著提高生长速度和生长效率，减少饲料消耗和脂肪沉积。以前，人们都是直接从猪的脑垂体中分离提取pST的，这使得pST的来源非常有限，从而导致价钱昂贵，不利于在农业生产中推广利用。随着基因工程技术的飞速发展，成千上万的外源蛋白基因在各种微生物和组织培养细胞中得到了有效的重组表达。1983年，Seeburg等最先从猪脑垂体中分离提取了pST的mRNA，并将扩增得到的eDNA构建到原核表达载体，使psT基因在E．coil中进行表达。之后，人们进行了大量类似的原核表达研究。由于

3、原核表达系统缺乏翻译后的加工修饰功能，且外源蛋白易形成包涵体．使得表达产物处于未折叠的状态．缺乏应有的生物活性。因此，近年来，人们把pST基因的表达研究转移到了真核系统．如哺乳动物细胞和酵母。本论文利用昆虫细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)对pST基因的表达进行了研究。首先，本研究利用既可高效表达外源基因又可形成多角体的杆状病毒表达载体pSXIVVI+X3／4构建了带有pST全长基因(pSTl基因，含自身信号肽序列)的重组质粒px3／4．pSTl。将pX3／4．pSTlDNA与致死缺失型线性化BaculoGoldTMAcMNPV．OCC-DNA共转染sf9细

4、胞，通过同源重组构建出含pST全长基因的重组病毒AcMNPV．pX314．pSTl．OCC+。SDS．PAGE和Westernblot分析结果显示得到了分子量约为22kD的融合蛋白，该rpST仅为胞内可溶蛋白，未能成功分泌到胞外。为使昆虫细胞中的表达产物能够进行正确的加工和分泌，本研究继而采用带有强信号肽序列的杆状病毒表达载体pAcGP67一A，使去除了自身信号肽序列的pST基因(pST2基因)与gp67信号肤基因在P。№(多角体启动予)的控制下共同表达。结果分泌表达的rpST占培养液上清总蛋白的3．61％，但仍不适于pST的商业化生产。最后，论文利用Ppastoris以期获

5、得能适于商业化生产的pST的高水平表达。此，通过PCR技术扩增出不带信号肽序列的pST2cDNA片段(约580bp)，其组建成重组质粒pPICZ也A．pST2。线性化的pPlCZt：tA．pST2用高压脉冲电流转化宿主菌PpastorisX．33，筛选转化子得到rpST分泌表达水平高的x．33／pPICZt埔．pST2／9。其培养液上清和细胞可溶蛋白中均有一条分子量约为22kDpST特异反应带．且分泌的rpST比天然pST略大一点．胞内可溶rpST的迁移速率跟天然pST差不多。线性化的pPICZ剖k．pST2再次电击转化x．33／pPICZctA．pST2／9，得到可在含20

6、00Ijtg／mlZeocin⋯的YPDS板上存活且能分泌更多rpST的重组菌。X-33／pPICZo．A—pST2／9—7分泌的rpST达956mg／L．且90％以上的rpST被成功分泌到培养液上清中。根据对pST表达的优化条件及表达产物的纯化进行研究的结果．将重组菌X．33／pPICZtzA．pST2／9．7用1．o％的甲醇诱导表达96h后的培养基上清用45％饱和度的(NH4)2S044℃沉淀过夜、沉淀重溶、s印hadex“G-25Fine脱盐及QSepharoseTMHi曲Performance阴离子交换层析后．rpST的纯度超过95％，回收率达71．4％。MALDI．

7、TOF-MS测定分子量为21771Da，比预测的理论分子量21860Da小89Da。三批纯化后的样品的等电点测定的结果一致，显示为3条带，ll其中中间1条主带的口，在4．55．5．2之间，但比预测的等电点(pl=6．24)和天然pST的(pl---'6)略小。胰蛋白酶水解的20个肽段中检测出14个，结合肽谱分析和分子量测定的结果，可推断rpST一级结构正确。x．33／pHCZaA．pST2／9．7表达上清可明显促进大鼠Nb2淋巴瘤细胞的增殖。当rpST浓度912．81ttg时，促细胞增殖能力与rpST浓