猪白介素18IL18成熟蛋白基因的原核表达及真核表达

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1、沈阳农业大学硕士学位论文猪白介素-18（IL-18）成熟蛋白基因的原核表达及真核表达姓名：耿庆华申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：杜绍范;曹殿军2003.6.1沈阳农业大学硕士学位论文捅要，，白细胞介素．18是近年发现的一种免疫调节因子，起初由于它能诱导NK细胞和n1细胞产生干扰素而被命名为干扰素诱生因子(Interferon—y-inducingfactor，IGⅢ)。随着对IL-18的深入研究，人们发现也．18有它本身的结构特点和很多其它生物学活性，因此于1996年被正式命名为白细

2、胞介素-18(Imerleukin-18，IL-18)。从IL-18被发现以来，人们对其进行了大量的实验研究，通过研究人们发现IL-18在不同时间和不同组织的选择性表达与很多疾病的发生、发展及治疗密切相关。目前的研究显示．IL-18不仅在抗肿瘤、抗微生物感染以及抗超敏反应等方面发挥一定的生物学功能。此外，IL．18还与自身免疫性疾病有关。由此可见IL．18具有多种生物学功能，并可能有广阔的应用前景。所以，不同种动物的IL．18纷纷在体外被克隆和表达出来．并试图进一步研究其生物学活性及其与疾病的关

3、系。目前．在国内猪的IL-18的体外表达还未见有报道研究．本研究即是将本实验室已经克隆的猪IL．18基因进行亚克隆并进行体外表达，为深入研究IL-18在临床中的应用提供材料。少本实验的目的是对已经构建好的猪IL—18的阳性重组质粒pMDl8-T-IL一18进行亚克隆．构建猪IL．18成熟蛋白基因的原核表达载体和真核表达载体并分别转化大肠杆菌和转染仓鼠肾细胞(BHK21)进行IL-18成熟蛋白的表达。、为了获得具有生物学活性的猪IL．18蛋白．，进一步探讨m-18更多的功能及对其应用前景的研究和开

4、发，本实验构建了猪IL-18基因的原核表达载体pPROEXrMHb—IL-18和真核表达载体pGFPC．IL．18，并分别转化大肠杆菌和转染仓鼠肾细胞(BHK21)，成功表达出猪IL-18的成熟蛋白。本实验方法是对已经获得的阳性重组质粒pMDl8．T-PIL-18用EeoRI和)cbaI进行双酶切，再与用EeoRI和XbaI进行双酶切处理的原核表达载体在DNA连接酶存花下进行连接，然后将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌BL21．经酶切和PCR鉴定．对获得的阳性重组质粒进行核苷酸序列测定。以终浓度为

5、0．6mmoI／LIPTG诱导转化后的大肠丰T菌使得外源目的基因IL·18得以表达·得到了高效表达的IL，l8菌体蛋白，SDS—PAGE电泳可见到表达的外源蛋白摘要大小约为23KD，与DNASIS软件推导的分子量大小相符合，薄层灰度扫描结果显示IL—18蛋白的表达量占菌体总蛋白的25．7％。同时，为了在真核细胞中表达成熟的IL--18蛋白，我们设计上下游引物P1、P2，上游引物即P1含有猪1I,-18的5。端同源序列和BamHI酶切位点，在BamHI酶切位点后加入了起始密码子ATG，以启动蛋白质

6、的翻译过程。下游引物即P2含有3’端同源序列和Xba／酶切位点。用Pl、P2以pMDl8一T-IL．18为模板扩增IL-18外源片段，用BamHI和XbaI双酶切PCR扩增的11_．18基因和真核表达载体，并用DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，并用酶切和PCR进行鉴定。将鉴定为阳性的真核表达载体质粒用脂质体转染法转染BHK2I细胞，经过G418抗性筛选，利用SDS．PAGE电泳分析表明表达的II_,-18目的蛋白在转染后的细胞上清中，同时收取转染后的细胞提取总RNA并除掉其中

7、的DNA后RT-PCR扩增出500bp左右的DNA条带。证明已经得到可以稳定传代培养的能分泌猪IL-18蛋白的细胞系。这样为进一步研究IL-18的结构、生物学活性及其在细胞水平和分子水平的作用机制。深入研究IL-18在疾病中的应用前景奠定了基础。』jj关键词：猪；白细胞介素．18七也．18)：原核表达；真核表达彳。、／2沈阳农业太学硕士学位论文刖舌白介素一18(1L一18)是近几年来发现的一种免疫调节因子。它是从先经过加热灭活的疮疱棒状杆菌(P．acnes)致敏后，又经脂多糖(LPS)攻击而发生

8、中毒性休克的小鼠肝细胞中分离并克隆出来的一种新的细胞因子。由于它能弓i起小鼠血清中IFN—Y水平上升，最初被称为IFN-Y诱导因子(IGIF)，表明它具有诱导NK细胞和_r细胞产生IFN—y的功能。最近的研究表明，除了能诱导产生IFN—Y的活性外，IL—18还具有增强Fas配体和穿孔素介导的T细胞和NK细胞的细胞毒活性作用；刺激Thl细胞的发育：上调粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL～2Ra；降低IL一10在T细胞中的表达和调节B细胞免疫球蛋白的分泌等～系列功能。IL—18促进炎