实时RT_PCR定量检测NGFmRNA表达水平方法的建立

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1、蚌埠医学院学报2012年1月第37卷第1期5［文章编号］1000-2200(2012)01-0005-02·基础医学·实时RT-PCR定量检测NGFmRNA表达水平方法的建立杨克红，祝晓光，蒋志文，刘浩，吴华璞［摘要］目的:建立一种用SYBRGreenⅠ实时定量逆转录(SYBRGreenⅠQ-RT-PCR)检测大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)mRNA基因表达的方法。方法:以Trizol一步法提取大鼠脑组织总RNA，以Oligo(dt)18为引物逆转录产生cDNA，利用SYBRGreenⅠ荧光染料法实时检测NGFmRNA的表达水平。通过熔解曲线分析NGF

2、mRNA检测的特异性，以管家基因β-actin为内参照对NGF进行定量分析。结果:建立的大鼠NGFmRNASYBRGreenⅠ实时检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立实时RT-PCR检测NGFmRNA基因表达的方法。［关键词］神经生长因子/生理学;大鼠;实时定量PCR［中国图书资料分类法分类号］R338［文献标识码］AEstablishmentoffluorescentquantitativerealtimeRT-PCRmethodfordetectionoftheexpressionofnervegrowthfactormRNAYANGKe

3、-hong，ZHUXiao-guang，JIANGZhi-wen，LIUHao，WUHua-pu(DepartmentofPharmacology，BengbuMedicalCollege，BengbuAnhui233030，China)［Abstract］Objective:Toestablishanewmethodfordetectingtheexpressionofnervegrowthfactormessengerribonucleicacid(NGFmRNA)incerebrumtissueofrats．Methods:TotalRNAwasi

4、solatedfromcerebrumtissuebyTrizol-one-stepmethod．SpecificoligonucleotideofNGFmRNAgenefragmentswereamplificatedbyRT-PCR．ThemethodofdetectionofNGFmRNAexpressionusingSYBRGreenⅠrealtimeRT-PCRwasconstructed．Thespecificityofthemethodwasconfirmedbymeltingcurve．Housekeepinggeneβ-actinwas

5、appliedtorectifythequantityofNGF．Results:SYBRGreenreal-timePCRwasdevelopedwithhighspecificityandsensitivityfordetectingofratNGFmRNA．Conclusions:ThemethodofdetectionofNGFmRNAexpressionusingrealtimeRT-PCRisconstructedsuccessfully．［Keywords］nervegrowthfactor/physiology;rat;realtimeR

6、T-PCR神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)属于级，体重280～320g，由蚌埠医学院实验动物中心提神经营养因子家族，其不但在中枢神经系统发育过供。根据随机数字表法将大鼠随机分为7组，分别程中起着重要作用，而且能够维持成熟的中枢及周为假手术组(SH)、脑缺血再灌注模型组(MCAO/R)［1］围神经系统神经元的正常功能。NGF能保护缺(0．9%生理盐水5ml/kg)、MCAO/R药物治疗组血性损伤的神经元，有效阻断缺血时神经元凋亡的(姜黄素20、40、60mg/kg)和MCAO/R阳性对照组［2－4］发生，且能够保护海马及皮质神经元

7、免遭低氧、(尼莫地平0．4mg/kg)及DMSO(二甲基亚砜)组，［5－6］低糖、谷氨酸的毒性及氧化损伤。本实验建立每组8只。了一种SYBRGreen实时RT-PCR的方法，对缺血大1．2药品及主要试剂药品:姜黄素(BIOMOL公鼠脑组织中NGF的表达进行动态观察。司产品)，溶媒(DMSO)(宜兴市展望化工试剂厂生产，批号:020822)，DMSO助溶配制成0．4%的姜黄1材料与方法素溶液。尼莫地平注射液(德国拜耳公司生产，规1．1实验动物与分组雄性SD大鼠56只，普通格:50ml/10mg)。模型组用生理盐水的配制方法:取75%乙醇2．5ml放入100

8、ml容量瓶中，加注射用生理盐水至100ml，混匀即可。试剂:Trizol(上海［