分子生物学》实验指导

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1、《分子生物学》实验指导实验1植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA

2、进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。13由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有

3、特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTABbuffer（pH8.0）100mMTris25mMEDTA1.5MNaCl3%CTAB2%β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/LTris·HCl

4、1mmol/LEDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]131、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎

5、片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。9、将粗制品溶于TE缓冲液。10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。实验结果第一组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶13液A260=0.022，A280=0.012，A260/280≈1.83第

6、二组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.020，A280=0.011，A260/280≈1.81第三组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.024，A280=0.013，A260/280≈1.84[注意事项]1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。[思考题]CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？液氮研磨的原理是什么？实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖-3,6-L半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼

7、脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0-9.0的缓冲液中稳定。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。[实验目的]13学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。[实