分子生物学实验指导-3

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1、北京化工大学分子生物学实验指导实验一少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组

2、到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringentcontrol）复制型和松弛控制型（relaxedcontrol）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制

3、时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如colE1质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkalinelysis）、热裂解法（boilingmethod）、氯化铯（CsCl）纯

4、化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicill

5、in(Amp)两种抗性筛选标记。碱裂解法：本实验是以alkalinelysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部2+分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。三、实验方法1.仪器用具:a.无菌操作台(laminarflow)b.台式型离心机(microcentrifuge)c.微量吸管(pipetman)d.真空干燥机(s

6、peedvac)e．漩涡混合器f．琼脂糖凝胶电泳仪2.材料:实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin(50μg/ml)的LB培养液中，并o在37C下振荡培养过夜。3.药品及试剂:a.SolutionI:25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0),50mMglucoseb.SolutionII:0.2MNaOH,1%SDS(使用前以10NNaOH与10%SDS稀释配制)c.SolutionIII:3M醋酸钾溶液(KAc,pH5.2)d.RNaseA:1mg/mle.TEbuffer:10mMTris-HCl(pH

7、8.0),1mMEDTA(pH8.0)f.100%乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)g.LB(Luria-Bertani)培养液:10gtryptone,5gyeasteextract,10gNaClin1Lh．酚/氯仿（1：1）溶液i．1xTAE电泳缓冲液：40mMTris-乙酸,1mMEDTA（pH8.0）j.DNAmarker：DL200034.实验步驟:1)将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000rpm离心1分钟后，倒去上清液。2)沉淀菌体加入50μlSolutionI，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于冰

8、上5分钟。3)加入100μlSolutionII，盖上管盖后将管子