分子生物学实验指导(1)

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1、生命科学系2009-2010学年度分子生物学实验（0601班）周玉亭122009-2010学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备实验二质粒DNA的转化实验三质粒DNA的提取实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验五PCR基因扩增实验六DNA重组与转化实验七蓝白斑筛选实验实验八DNA酶切技术实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球

2、型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台2.低温离心机3.恒温摇床4.紫外分光光度仪四、材料与试剂：1.大肠杆菌top10菌株2.0.1mol/LCaCl2溶液500mL、0.2mol/LCaCl2溶液50mL3..LB液体及固体培养基4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤：1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mLLB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mLLB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600应在0.4～0.5之间)3.

3、将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/LCaCl2溶液、50%甘油预冷）4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。5.用冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的0.2mol/LCaCl2溶液12、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。实验二质粒DNA的转化一、实验目的：掌握质粒

4、DNA的转化技术二、实验原理:DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Ampr）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。三、仪器：1.超净工作台2.恒温摇床3.恒温水浴四、1.材料与试剂：LB培养基（液体、固体平板）2.感受态3.无菌水五、实验操作步骤：1.200µL新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2µL（约5～50ng）混匀，冰上放置30min。同时做一对照试验：200µL感受态+2µL无菌水，其他操作同上述实验完全

5、一样。2.将上述管放到42℃水浴中，精确计时90秒。3.冰浴2min。4.复苏：管中加入LB液体培养基800µL，37℃培养1h（50r/min）5.涂平板：取200µL复苏细胞，涂布于含AMP的LB培养基上。待大约30min，让菌液被培养基吸收。6.菌落培养：倒置平皿，37℃培养12～16h，转化子即可长成菌落。照相。12实验三质粒DNA的提取一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法二、实验原理  碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的D

6、NA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。三、仪器、材料与试剂  (一)仪器  1．恒温培养箱  2．恒温摇床  3．小型高速离心机  4．漩涡混合器  (二)材料与

7、试剂 材料：带有pGEM-T质粒的大肠杆菌 试剂：1. SolutionI[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HCl（PH8.0）,10mmol/LEDTA(PH8.0)]2..  SolutionII（0.4mol/LNaOH+2%SDS用前等体积汇合）3.  SolutionIII(5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5mL,DH2O28.5mL)4.  TE缓冲液(PH8.0)[10mmol/LTris.HCl(PH8.0),1mmol/LEDTA(PH8.0)]5.0.5mo1／L(EDTA)6.氯仿：异戊醇（24：1）7

8、.Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比）8. RTE(含20µg/mLRNA酶A的TE缓冲液)