分子生物学实验指导

《分子生物学实验指导》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、分子生物学实验指导基础实验实验二十五核糖核酸的测定【实验目的】1．掌握RNA的测定原理2．掌握RNA定量技术【实验原理】RNA分子中的核糖在浓酸中加热，脱水转变成糖醛，后者在氯化铁存在下，与地衣酚试剂（3，5-二羟基甲苯）反应，缩合成绿色化合物，在670nm处有最大吸收峰，从而可进行定量测定。待测样品中的RNA浓度在20～200µg/mL之间时，其吸光度与浓度成正比。反应式如下：核糖糖醛绿色化合物【实验内容与方法】1．取中试管3支，按表2-17操作表2-17RNA的测定方法试剂（mL）标准管标本管空白管RNA标准液1.0

2、RNA提取液1.0蒸馏水1.0地衣酚试剂3.03.03.02．混匀各管，置于沸水浴中加热10min，取出冷却，以空白管调零点，在670nm波长处比色，读取各管的吸光度。3．计算【实验准备】1．RNA标准液准确称取RNA用0.001mol/LNaOH配制成100mg/mL的溶液。2．地衣酚试剂称取地衣酚（3，5-二羟基甲苯）100mg，溶于100mL浓盐酸（AR）中，再加入100mgFeCl3.6H2O。应用前新鲜配制。3．仪器：紫外可见分光光度计、试管、刻度吸管（孔峰张孟业）实验二十六脱氧核糖核酸提取【实验目的】掌握DN

3、A分离纯化的原理和方法【实验原理】见RNA提取。【实验内容与方法】1．肝匀浆制备与RNA分离，见RNA的提取。2．于含有DNP的沉淀中加入二倍体积的1mol/LNaCl溶液搅拌均匀，室温放置5～6h，以充分提取DNP。3．去除蛋白质将放置完毕的DNP混悬液离心3000rpm/10min，上层转移至另一试管中，加入等体积氯仿-异戊醇混合液，用玻璃纸堵住管口振摇2min，离心3000rpm/10min，此时管中液体分为三层，下层为氯仿，中层为变性的蛋白质，上层为含有DNA的水溶液，将上层转移至另一小试管中（中、下层弃去），加

4、二倍体积冰冷的95%乙醇，边加边摇匀，此时可见有白色纤维状DNA（或为乳白色紊状沉淀），离心3000rpm/5min，弃去上层乙醇溶液，沉淀即为DNA的粗制品。【实验准备】1．1.0mol/LNaCl溶液2．仪器：高速组织捣碎机、离心机、紫外可见分光光度计【注意事项】(1)在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，并尽快加入0.14mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防止DNA的分解以提高核酸得量。(2)各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。（孔峰张孟业）实验二十七脱氧核糖核酸的测定【

5、实验目的】1．掌握DNA的比色测定原理2．掌握DNA定量技术【实验原理】DNA分子在酸性溶液中加热水解后，其脱氧核糖部分可被浓酸缩水成ω-羟基γ-酮基戊醛等化合物，再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收峰。从而可进行定量测定。待测样品中的DNA浓度在20～200µg/mL之间时，其吸光度与浓度成比。反应式如下：脱氧核糖ω-羟基-γ-酮基戊醛【实验内容与方法】1．取中试管3支，编号，按表2-18操作表2-18DNA的测定方法试剂（mL）标准管标本管空白管DNA标准液1.0DNA提取液1.0蒸馏水1

6、.0二苯胺试剂2.02.02.02．混匀各管，置于沸水浴中加热10min，取出冷却，以空白管调零点，在595nm处比色，读取各管的吸光度。3．计算：【实验准备】1．DNA标准液准确称取DNA用0.01mol/LNaOH配制成400µg/mL溶液。2．二苯胺试剂称取二苯胺1.5g（如不纯，须用70%乙醇重结晶两次），溶于100mL冰醋酸（AR）中，再加入浓硫酸1.5mL，贮存在棕色瓶中放入冰箱内保存备用。3．仪器：紫外可见分光光度计，试管，刻度吸管。【思考题】1．本实验中，测定RNA和DNA含量的原理是什么？2．核酸在细胞

7、质和细胞核中的分布有何特点？（孔峰张孟业）实验二十八真核细胞DNA的制备与定量【实验目的】掌握真核生物细胞基因组DNA制备和定量的基本方法。【实验原理】制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性。一般真核细胞基因组DNA有107～109bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而获得DNA，DNA经酶切后可用

8、于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:①防止和抑制DNase对DNA的降解;②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。【实验内容与方法】1．细胞处理(1)收集对数生长期的培养细胞约5×106于1.5m