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1、实验一.动.植物组织总RNA的提取一、材料、试剂和仪器材料：动物组织，一次性塑料手套，200川、1000川吸头。试剂：TRIzol总RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1%DEPC,75%乙醇（JIJRNase-free水配制），RNase-free水。仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵二、提取操作步骤1、匀浆处理：a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。取新鲜或・7（TC冻存组织，大约10-30mg组织加lmlTRIquick,用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。b
2、、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cn?面积加1mlTRIquicko川取样器吹打混匀。c、细胞悬液：离心收集细胞。每5-10X106动物、植物和酵母细胞或每心细菌细胞加1mlTRIquickod、血液处理：宜接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8,000-10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集口细胞沉淀。每100-200卩1血液收集的口细胞沉淀加入1mlTRIquicko2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。如不连
3、续进行实验,加入TRIquick的匀浆样品可在一70'CK保存1-2个月。3、可选步骤：4°C12,000rpm离心5・10分钟，取上清。如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀屮包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNAo处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。4^每使用lmlTRIquick向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3・5分钟，使其自然分相。如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代
4、替。5、4°C12,000ipm离心10-15分钟。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常为550^1）转移到新管中。6、在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，混匀，室温放E10-20分钟。7、4°C12,000rpm离心10分钟。去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8、加入1ml75%乙醇（用RNase-free的水配置）洗涤沉淀。每使用1mlTRIquick,至少加1ml75%乙醇。9、4°C7,000rpm离心5分创》齐上清；短暂
5、快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不耍吸取到沉淀。转速不耍超过7,000rpm,否则盐离子会沉淀下来，导致RNA不易溶解。10、室温放置晾干（不耍晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干1-2分钟左右即可），加入适量RNasc-frcc水（根据实验需要加入30-100卩1水），充分溶解RNA。11、RNA样品一70°C下保存。预防RHase污染，应注意以下儿方而：1、经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2、使川无RNase的塑料制品和枪头避免交义污染。3、RNA在TRIqui
6、ck试剂中时不会被RNase污染。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器IIIL。玻璃器IIIL可在15（）°C烘烤4小时，塑料器IIIL可在（）.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNaseo4、配制溶液应使用RNase-free的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（v/v）,放置过夜,高压灭菌）。不同纟I［织或细胞RNA提取预期得率植物叶片100—200pg/g叶片动物组织200—400pg/g肝脏组织动植物培养细胞5—10pg/I0
7、6细胞革兰氏阴性细菌2—10pg/mlDH5«过夜菌血液3—5pg/ml人全血RNA纯度及浓度检测：完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件:胶浓度1・2%；0.5XTBE电泳缓冲液；150V,15-30分钟）检测完整性，由于细胞中70-80%的RNA为rRNA,电泳厉UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当子28S和18SrRNA；植物叶片中山干含有大量的叶绿体RNA,可见4条或更多rRNA；细菌rRNA人小分别约为4kb和2kb,分别相当于细菌23S和1
8、6SrRNA。RNA样品屮最人rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则衣示RNA样品的降解。出现弥散状或条带消失表明样品严重降解。纯度：OD260/OD280比值是衡杲蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数（10mMTRis,pH7.5）在1.8-2.1Z间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA
