[精品]分子生物学实验指导

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1、分子生物学实验从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因一、实验思路与设计：口的基因的获取是基因工程的重要步骤，也是研究基因的进化、功能等的必要手段。本实验设计从基因组DNA提取开始，通过DM的提取及质量检测、常用生物信息库的查询、电子延伸、DNAstar软件的使用、PCR仪的编程与使用、载休构建、感受态细胞的制备、重组子的筛选和扩培、质粒的提取与检测等实验,使学生掌握基因克隆的基本思路和方法。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs,EC2.5.1是分了量为25-29kI)的同源或异源二聚体酶类。其作用是将将谷胱甘肽转移到各种冇毒物质的亲电分子上去。GSTs在机体有毒化合物的代谢、保护细胞免受急性毒性化学物质

2、攻击屮起重要作用。此外，亲电子致癌物可被GSTs分解，所以GSTs有抑制细胞癌变的功能(SeidegardJ,etal.,1997)o谷胱廿肽硫传移酶作为一种具冇广谱抗氧化活性的物质已用于癌症等疾病的治疗。编码GSTs的基因是一类古老而11广泛存在的基因家族。植物GSTs家族各成员之间的差异很大，它们只有一个长15个氨基酸的保守域(Marrs,1996)。Droog等人(1995)建议根据序列保守性，免疫交叉反应活性和基因内含子和外显子的结构将植物的GSTs分为三个亚类，I型GSTs冇两个内含子，英翻译和转录受诸如脱水(Kiyosueetal.91993),损伤(Kimetal.91994),

3、活性氧(Bartlingetal.,1993),病原菌攻击或激索(生长索和乙烯)(ZhouandGoldsbrough,1993；Akahashi刃加.，1995)的影响。II型GST的序列有9个内含子，此类型的GST序列只在荷兰石竹中发现(Meyer刃川.，1991；ItzhakiandWoodson,1993)。III型GSTs只有一个内含子，其转录和翻译受各种植物激素(Takahashi刃刃.，1989,Droogetal.,1993)病原菌侵袭(Tayloretal.,1990)及重金属(Czameckaetal.,1988；Hagenetal.,1988,MarrsandWalbot

4、,1997)的诱导。研究植物GST最初口标在于确定不同作物对除草剂的抗性，但是对其在细胞正常代谢过程中所起的作用知道的较少(JohnandKathryn,1998；Mars,1996)。对麦类作物GST的研究主要集中在其抗除草剂的作用上，由抗除草剂诱导的在小麦中表达得到的GST主要是I型的GST,它们只含冇一个内含子并将其定位在小麦的第六部分同源群上(RiechersetaL,1994,1996a,1996b,1998)o本实验采用同源序列克隆的方法从小麦基因组克隆小麦GST的基因组序列。二、具体实验安排实验一小麦基因组DNA提取小麦种了表面消毒后浸泡在蒸懈水中浸泡12小时，露白后转入培养皿中

5、，室温条件下生长至两叶一心时采集叶片，立即用液氮处理后，置于・70°C冰箱中保存备用。总DNA采用Sharp等(1989)捉出并经Devos等(1992)改进的酚一氯仿法提取。具体步骤如下：1)将适量新鲜叶片液氮低温下磨碎，取适量置于1.5ml离心管中，加500卩1“S”befferClOOmMTris.HClpH8.0,100mMNaCl,50mMEDTApH8.0,2%SDS,(现配现用)65°C预热)，65°C水浴约lh。2)加入500(11酚一氯仿(1:1),混匀后lOOOOrpm离心10min；取上清液加入0.6倍体积异丙醇，混匀并静置一会儿后，lOOOOrpm离心10min,倒掉液

6、相，用200ul70%乙醇将DNA洗1-2次后干燥。3)将DNA溶于500

7、nllXTE(pH7.0),加5plRNA酶(10mg/ml),37°C保温lh；加500(11氯仿，轻轻混匀后1OOOOrpm离心10min。取上清液加入2倍体积冷无水乙醇(或95%乙醇)，轻轻混匀并静置一会儿后100001-pm离心lOrnin,轻轻倒掉液相，待DNA干燥后溶于25ul!XTE(pH7.0)o实验二从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因根据GeneBank上公布的具有基因组序列的两个小麦GST序列GSTA1(X56012)和GSTA26X56004)及其它小麦057的mRNA的保守序列设计如下引物：

8、引物碱基碱基序列产物长度名称长度gDNAcDNAGcds285，ATGTCTCCGGTGAAGGTGTTCGGGCAC3'l.lkb900bpFowardGcds305'TTAAAGCAAGGAATCCGGGCTCGCACGAGC3'Reverse引物Gcds开始于起始密码子结束于终止密码子，其cDNA的扩增产物应该包含完整的开放阅读框。基因组PCR反应体系以基因组DNA进行基因组PCRoPCR反