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《【精品】药学本科分子生物学实验指导》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验项目一：总RNA的提取(必做)一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的捉取和分析方法。三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNAo四、实验耍求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA吋，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1%的二乙基焦碳酸盐(diethylpyrocarbonate,DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。五、实验所需仪器设备移液器及吸头，电泳
2、仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪等六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNAo最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可冋收RNA；七、实验步骤1.颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2.将肝脏用ddH20冲洗几遍，去除血液3.将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，
3、4•冷冻离心机冷却到4°C（预冷半个小时）。准备冰盒。5.戴口罩，戴手套。6.每个EP管中,加入lOOmg左右的组织，加入ImLTrizol试剂，7.超声破碎仪破碎细胞8.剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。9.加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。10.离心:4°C,13,OOOrpm,lOmin。11.取新EP管。将上层水相（约600uL）加入新EP管，12.再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。13.离心：4°C,13,OOOrpm,lOmirio解RNA。15・
4、-70度保存提取的总R7A。八、注意事项1.RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶,所以操作吋应戴手套。2.RNA提取用品准备:1）普通的玻璃器皿:180°C烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制晶：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。3）用烘烤过的药勺称取试剂。4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37°C至少处理12小时,高压灭菌15mino实验结果:成功从植物中分离得到总RNA实验项目二：总
5、RNA的纯化和鉴定（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法三、实验内容1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNAo2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA四、实验要求1、学会纯化植物总RNA的方法2、学会定量、定性检测RNA的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪，微波炉或电炉，紫外透射仪，照相机、紫外分光光度计六、实验原理乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。在阳离子的足量时，
6、可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。反复利用乙醇沉淀RNA,可以起到纯化RNA的作用。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA,总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18SrRNA；植物叶片屮由于含有大量的叶绿体RNA,可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb,分别相当于细菌23S和16SrRNAoRNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥
7、散片状或条带消失表明样品严重降解。0D260/0D280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，0D260/0D280值(lOmMTYis,pH7.5)在2.0左右。0D260/0D280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mMTris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1・5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNasc-fr
8、cc水将分光光度计调零，取稀释液进行0D260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/p1)=OD260Xn(稀释倍数)X40七、实验步骤(-)总RNA的纯化1.提取的总RNA,加入75%乙醇500uL洗涤。2.离心：4°C,7,500rpm,5mino3.去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。4离心：4°C,7,500rpm,5mino5.去上清液，空气干燥5-10分钟。(RNA不可以完全干燥，防I上复溶的吋候困难)5.加入20-30uLDEPC水，55°C10mi
