药学本科分子生物学实验指导

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1、实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。五、实验所需仪器设备与试剂仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离

2、心机,恒温水浴锅,微量移液枪等试剂：TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（DEPCH2O配制）、DEPCH2O六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；七、实验步骤1.颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2.将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3.将

3、大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。准备冰盒。5．戴口罩，戴手套。6.每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mLTrizol试剂，7.超声破碎仪破碎细胞8.剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。10.离心：4℃，13,000rpm，10min。11．取新EP管。将上层水相（约600uL）加入新EP管，12.再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。13.离心：4℃，13,000rpm，10min。14

4、.去上清夜，加入20-30uLDEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。15.-70度保存提取的总RNA。八、注意事项1．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。2．RNA提取用品准备：1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。3）用烘烤过的药勺称取试剂。4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min

5、。实验结果:成功从植物中分离得到总RNA实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法三、实验内容1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA四、实验要求1、学会纯化植物总RNA的方法2、学会定量、定性检测RNA的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计六、实验原理乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团

6、暴露出来。在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。反复利用乙醇沉淀RNA，可以起到纯化RNA的作用。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18SrRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16SrRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现

7、弥散片状或条带消失表明样品严重降解。OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mMTris,pH7.5）在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mMTris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，

8、取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：   终浓度（ng/μl）=OD260×n(稀释倍数)×40七、实验步骤（一） 总RNA的纯化1．提取的总RNA，加入75%乙醇500uL洗涤。2.离心：4℃，7,500rpm，5min。3．去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。4离心：4℃