生物技术综合实验

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1、生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology主要内容Contents：一、课程简介核酸的分离与纯化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、电泳技术AgaroseGelElectrophoresisandSDS-PAGE三、聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction四、DNA序列测定DNASequencing五、分子杂交技术MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文库和cDNA文

2、库的构建ConstructionofcDNALibraryandDNALibrary七、外源基因的克隆与表达HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白质的分离、纯化技术IsolationandPurificationofProtein课程简介现代生物技术综合性实验是以分子生物学为基础的基因克隆重组技术和生物化学的蛋白质分离、纯化技术为核心的教学，它是现代生物技术的核心。主要内容：包括实验理论和实验技术实验技术－生物技术综合实验，它是集目的基因的制备、克隆、表达和蛋白质的分离纯化及其活性测定等实验方法和技术为一体的一门综合性实

3、验课。目的：通过本门课程的学习，使学生掌握现代生物工程的上、下游实验技术，对以基因克隆重组技术为主线的生物实验技术有一个较全面的了解。教学要求通过教学，要求学生掌握分子生物学与基因工程的基本理论，巩固所学的理论知识；使学生了解科研工作的基本思路，学会如何设计实验，如何分析实验，培养分析问题和解决问题的能力；培养和训练学生的基本实验技能，培养学生的独立工作能力和创造能力。掌握基因重组的基本过程，如：核酸DNA、RNA和质粒DNA提取、酶切、连接、转化及重组子的酶切鉴定等技术。掌握外源基因的表达技术和蛋白质电泳分析技术，蛋白质提取、分离和纯化技术。核酸的分离与纯化

4、Isolationandpurificationofnucleicacids不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。核酸的种类：真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞器DNA为双链环状分子；原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子；RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有ploy(A)结构;tRNA的三叶草结构。病毒的DNA、RNA，其

5、存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。一、核酸分离提取的原则分离纯化核酸总的原则①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染，保证较高纯度。2.核酸的分离、纯化应达到以下三点要求：①排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学因素对核酸

6、的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10条件下进行；③减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素主要是机械剪切力，其次是高温。④防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各种核酸酶（DNA酶、RNA酶）酶解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。掌握真核生物基因组DNA的提取

7、的基本原理。提取高质量基因组DNA的主要用途：PCR扩增的模板用于构建基因组文库用于Southernblot杂交分析二、真核细胞染色体DNA的制备真核细胞染色体DNA的制备过程1.真核细胞的破碎（1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可导致DNA链的断裂。（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。2.去除蛋白质常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构建基因组文

8、库。根据不同的实验要求，可选择不同的实