《生物技术综合大实验》

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1、真菌HOG1及PBS2基因功能验证一、实验原理许多真核生物，在胞外渗透压增加时能够通过提高胞内渗透压进行调节。虽然真核生物能够对胞外信号刺激进行感应并传递信号，但是对细胞发生应答反应的机制了解甚少。酵母在长期的进化过程中，形成了精确而敏感的适应机制。细胞通过感受周围环境的变化，激活胞内信号传导途径，从而对外部环境刺激作出应答，其中之一就是激活高渗透压通路（HOG）的相关因子以适应外部环境的变化（Gustinetal.,1998;George&Sprague,1998;Estruch,2000;O’Rourke&Herskowitz,1998,2

2、002）。酿酒酵母通过增加甘油的合成与储存，保持细胞内水分含量，防止细胞脱水和蛋白质集聚，提高细胞内部渗透压，从而对胞外渗透压的增加作出应答反应（Brewateretal.,1993;Seanetal.,2004;Welsh,2000）。HOG途径是酵母细胞在高渗条件下进行的渗透压调节反应所必需的，它主要通过积累胞内甘油通过细胞膜来维持渗透压梯度。酵母HOG信号转导过程通过HOGMAPK级联途径完成。HOG途径的主要组成成分是MAPK的模式，即一个MAPK（Hogl），一个MAPKK（Pbs2），和三个MAPKKK（Stell、Ssk2和Ssk

3、22）。在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中，HOG通路受到MAP激酶－Hog1p的调控（Alepuzetal.,2003）。MAPK激酶－Pbs2p蛋白是Hog1p的上游激发子，可以通过细胞膜上的两个跨模蛋白―Sho1p及Sln1p分别引起的两条上游分支通路来激活（Maedaetal.,1995）。酿酒酵母细胞膜上存在两种跨膜渗透压感受器：Sln1和Sho1。它们能够独立地调控渗透压胁迫条件下HOG途径的激活，这两支上游途径分别被称为SLN1和SHO1途径（deNadaletal.,2002;Hohmann,2002

4、;O’Rourkeetal.,2002;Saito&Tatebayashi,2004;Sheikh-Hamad&Gustin,2004;Westfalletal.,2004;Marcusetal.,2006）。任意一条分支途径被激活均可引起Hog1的Thr174和Tyr176残基双重磷酸化，并导致Hog1从细胞质向细胞核内转移。进入细胞核的Hog1激活Hot1、Msn2/Msn4、Sko1和/或Smp1等转录因子，这些转录因子进而调控甘油形成所需基因的表达（MarcusKrantzetal.,2006）。甘油的过量表达对细胞是有害的，因此细胞中

5、的蛋白磷酸酯酶（proteinphosphatases）Ptp2、Ptc1、Ptc2和Ptc3可以对磷酸化的Hog1进行去磷酸化，从而降低Hog1的活性以达到对甘油合成量的控制。通过对Hog1活性的合理调控，细胞就可以合成所需的甘油量，以应对外界渗透压的变化（O’Rourkeetal.,2002）。HOG通路两个上游分支均可使Pbs2及Hog1磷酸化、转运、功能基因的诱导、以及在高渗环境中生长（Posas&Saito,1997;VanWuytswinkeletal.,2000），但是，在Hog1磷酸化时，它们对渗透压的敏感性存在差异（Maeda

6、etal.,1995;VanWuytswinkeletal.,2000）。此外，Pbs2通路上游Sho1分支还对假菌丝的发育有关（O’Rourke&Herskowitz,1998;RamezaniRadetal.,1998）。因此，Sho1和Sln1分支可能决定不同靶基因的转录过程（见图1.1）。图1.1酵母细胞HOG通路模式图Fig1.1ModelofHOGpathwayintheyeastcellHOG途径不仅是渗透压胁迫的各种反应所需的，而且也是由高渗胁迫激活的（Gustinetal.,1998）。HOG途径在诱导胁迫反应基因的表达，细胞

7、形态恢复和信息素反应途径的阻遏及其致病性等方面都起重要作用。胁迫反应时，MAPK级联反应途径在调节细胞周期方面起非常重要的作用（Degolsetal.,1996）。胁迫反应途径作为一种细胞周期的正调节因子的生理功能预示胁迫能促进细胞周期。二实验目的了解并掌握真核基因功能研究方法；掌握酵母菌感受态制备方法及转化方法。三、试验材料3.1主要试剂、酶、菌株酵母质粒提取试剂盒（100次）、细菌质粒小提取试剂盒（100次）；ssDNA、PEG4000、LiAc、Nacl、YeastExtract及Peptone、无氨基酸酵母氮原（YeastNitroge

8、nBasewithoutaminoacids，YNB）及各种氨基酸；BsrGI酶，DNAMarker分子量为15000bp一管，2000bp一管；酿酒