生物技术综合大实验.docx

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1、2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化1.文献综述绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团

2、，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国WoodsHole海洋生物学实验室的OsamuShimomura(下村修)、哥伦比亚大学的MartinChalfie和加州大学圣地亚哥分校的RogerY.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。下修村首次从Aequoreavictoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。MartinChalfie证明了GFP作为多

3、种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。2.实验器材2.1实验材料：含GFP融合质粒，Top10菌株2.2实验试剂：质粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2MNaOH/1%SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M醋酸；无水乙醇，7

4、5%乙醇，TEBuffer；转化：0.1M预冷CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；GFP提取：液氮，LysisBuffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，StartBuffer(A液20mMTris-HCl，pH7.0（透析液）)Elutionbuffer(B液20mMTris-HCl，1MNaCl，pH7.0)SDS-PAGE电泳：PEG10000，LoadingBuffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘

5、油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等2.3实验仪器高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。3.实验方法3.1质粒提取1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5mlEP管中；6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心8min，

6、弃上清；7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；9.加40μLTEBuffer溶解DNA，4℃备用。3.2感受态细胞的制备以及转化1.取1.5mLTop10菌液，在4℃4000rpm离心10min，弃上清；2.加200μL预冷的0.1MCaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃4000rpm离心10min，弃上清；3.加200μL预冷的0.1MCaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；5.42℃热激90s；6.立即放在冰上3-5min；7

7、.加入800μLLB液体培养基，37℃150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）；8.取200μL菌液涂布在LB（Amp100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。3.3扩大培养1.取含GFP质粒的Top10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL的LB液体培养基，100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37℃，200rpm振荡培养至对数生长期（约3-4h）；3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mLLB液中（Amp工作浓度100ng/ml，阿拉伯

8、糖工作浓度2mg/ml），37℃，200rpm培养过夜。3.4细胞破碎1.将培养好的细菌3000g离心10m