生物技术综合实验

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1、生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology主要内容Contents：一、课程简介核酸的分离与纯化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、电泳技术AgaroseGelElrctrophoresisandSDS-PAGE三、聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction四、DNA序列测定DNASequencing五、分子杂交技术MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文库和cDNA文库的构建Construct

2、ionofcDNALibraryandDNALibrary七、外源基因的克隆与表达HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白质的分离、纯化技术IsolationandPurificationofProtein核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。杂交是指亲源关系相近的不同来源的DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。Part5分子杂交MolecularHybrid

3、ization(DNA,RNA&protein)杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)。为了便于示踪（检测杂交信号），探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性核素，近年来也发展了一些非放射性标记物。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术在分子生物学领域中被广泛应用于：基因克隆的筛选基因表达水平的定性和定量检测

4、基因组中特定基因序列的定性和定量检测基因突变分析疾病的诊断核酸分子探针的标记：放射性标记、非放射性标记核酸分子杂交：膜上印迹杂交、液相杂交、原位杂交本部分重要内容在化学及生物学意义上的探针(probe)，是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可以被特殊的方法所探测。例如抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、激素—受体等的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。一、核酸分子探针的标记(labelingofprobe)（一）概述所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，然后用特定的方法进行杂交信号的检测。从而可以用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。探针

5、的选择与特异性核酸探针分为两种类型：克隆探针与合成的寡核苷酸探针克隆探针序列较长、复杂性大。随机性小，特异性高合成的寡核苷酸探针相对较小，18-50bp，G,C含量在40-60%之间，探针内不含互补区，探针内不含一个碱基的多次重复（长度4）如GGGGG等。（二）探针的种类根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为：基因组DNA探针cDNA探针RNA探针人工合成的寡核苷酸探针根据研究目的不同，可以采用不同类型的核酸探针。探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结果的分析。要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物(即标记物)进行标记。核酸分子探针的标记是核酸分子杂交的基础。（

6、三）各种标记物及其选择①检测方法要有高度灵敏性，同时应具有高度特异性，尽量减低假阳性率。②标记物与核酸探针分子的结合，应不影响探针分子的主要理化特性，特别不应影响杂交特异性和杂交稳定性；1.理想的探针标记物，应具备以下几种特性④标记反应的效率和标记产物的比活性应较高；⑤如果要求更严一些，它还应具有较高的化学稳定性，保存时间较长，标记及检测方法简单；对环境无污染，对人体无损伤；价格低廉等。优点：放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，因此对各种酶促反应无任何影响，也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质。另外放射性同位素的检测具有极高的特异性，极少出现假阳性结果。2.几种常见的

7、探针标记物（1）放射性同位素主要缺点：易造成放射性污染；不够稳定（有半衰期）。放射性同位素与相应的元素具有完全相同的化学性质，是因为二者之间的差别只在中子数目上，质子和电子数完全一致，而元素的化学性质是由其核外电子决定的，例如：32p、35S、3H、125I等。优点：无放射性污染、较稳定（可以较长时间保存，从而更便于临床诊断应用）。缺点：灵敏度和特异性都不太高。（2）非放射性标记物荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明类等。半抗原：生物素、