生物技术综合实验comprehensiveexperimentsofbiotechnology课件

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1、生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology主要内容Contents：一、课程简介核酸的分离与纯化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、电泳技术AgaroseGelElrctrophoresisandSDS-PAGE三、聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction四、DNA序列测定DNASequencing五、分子杂交技术MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文库和cDNA文库

2、的构建ConstructionofcDNALibraryandDNALibrary七、外源基因的克隆与表达HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白质的分离、纯化技术IsolationandPurificationofProtein7外源基因的克隆与表达HeterogenousGeneCloningandExpression基因工程诞生的历史背景:1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944）2.DNA结构双螺旋模型(Watson&Crick,1953)3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg&

3、Crick）4.发现反转录酶(Baltimore&Temin,1970)5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究(Lederberg,1950-1970)6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，Smith和Nathans）7.DNA体外重组（Cohen等，1973）1972PaulBerg&HerbBoyerProducedthefirstrecombinantDNAmolecules.TheySharedthe1980NobelPrizeinChemistry"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistry

4、ofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA",PaulBergHerbBoyer1973年是基因工程的元年。这座里程碑的树起，凝聚着几代科学家的心血与努力，他们在理论与技术上的卓越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的基础。一、基因克隆的策略与技术路线克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成的群体的过程。在分子水平，为了达到大量获取同一基因或基因的表达产物这一目的，采取体外进行靶DNA分子与某一微生物载体杂合，导入宿主细胞，通过自主复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前基因克隆的主要策略。1.

5、基因克隆的策略克隆外源DNA基本流程图示2.DNA克隆技术涉及的主要过程与方法（1）分离制备待克隆的DNA片段；（2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接；（3）重组DNA分子转入宿主细胞；（4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子；2.1分离制备待克隆的DNA片段的方法（1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然后分离所需要的DNA片段（原核基因）；（2）从细胞中分离所需要的mRNA，通过反转录合成cDNA（真核基因）；（3）用化学法人工合成DNA。2.2靶DNA片段与载体的连接2.2.1载体的选择与改造应具备下几个条件：(1)载体上应具备完成实验目的的最基本元件：如载体

6、上应具有适当的启动子、终止子等。(2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取代该区段，形成的重组子可在宿主细胞中复制和增殖。(3)载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯。(4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。(5)对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子、信号肽序列、SD顺序、加尾信号、增强子等调控元件。限制性内切酶处理DNA后，一般产生

7、粘性末端、平末端两种形式。两个DNA片段有以下几种出现方式：①两个不同的粘性末端；②两个相同的粘性末端；③一个粘性末端一个平末端；④两个平末端。注意：提高连接效率、降低假阳性！2.2.2DNA的连接2.3重组DNA分子（重组子）转入宿主细胞受体细胞也称宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌等（原核细胞不但是重组子复制扩增的场所，也可以作为外源基因的表达系统）。真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等。宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一个适当的宿主细胞，具有以下几个要求：①对重组子的复制和扩增没

8、有严格的限制；②不存在特