生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology.ppt

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1、生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology主要内容Contents：一、课程简介核酸的分离与纯化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、电泳技术AgaroseGelElrctrophoresisandSDS-PAGE三、聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction四、DNA序列测定DNASequencing五、分子杂交技术MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文库和c

2、DNA文库的构建ConstructionofcDNALibraryandDNALibrary七、外源基因的克隆与表达HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白质的分离、纯化技术IsolationandPurificationofProtein1表达蛋白质的分离沉淀蛋白质分离收集菌体洗涤破碎细胞等电沉淀盐析沉淀高分子物质分级沉淀超声破碎化学法溶菌酶上清液培养基1.1凝胶过滤层析凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶小球具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液

3、中的物质就按不同分子量筛分开了。凝胶过滤层析柱胶球大小-介质离子粗细影响流动(1)胶球颗粒有一定大小，一般可分为corse,medium,fine,superfine四种粗细(grade)；越粗的胶体，流率越好，但分辨率越差。因胶球外面的缓冲液是由胶球表面向内扩散，样本蛋白质也是以扩散方式进入胶球，再由中心向外扩散出来。胶球半径越大，扩散距离越大，效果越差。(2)下图说明这种扩散介质的机制。而近年来因材料科学的进步，发展出通透性特强的胶球，缓冲液可直接浸润而进入胶球，不需经过扩散作用，是为dispersion弥散式的胶体，效果较好且快速。商品化称为pe

4、rfusionchromatography。胶球大小-介质离子粗细影响流动二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。两大类离子交换介质由介质带电基团的不同，可分为两大类：介质－带电基团(counterion)(1)阳离子交换介质(cationexchanger)：载体-阴离子基团.....阳离子(2)阴离子交换介质(anionexchang

5、er)：载体-阳离子基团.....阴离子阳离子：两价阳离子>NH4+>K+>Na+>H+>Li+阴离子：I->Br->Cl->HCO3->CH3COO-,OH-四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的

6、配体仍保持束缚特异物质的能力。特异性配体亲和层析法与通用性配体亲和层析法特异性配体亲和层析法：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。通用性配体亲和层析法：配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。金属螯合亲和层析a.许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可能会吸附该金属。b.若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会专一性地吸附需要此金属的蛋白质。c.基因操作时，经常在表达蛋白质的末端加上一段含有六个

7、His的片段；则此表达蛋白质，可以吸附到含有镍的吸著剂上，可以用咪唑流洗出来。d.这种载体上结合有某些可与金属产生配位键的基团(如nitrilotriaceticacid)，这些基团与金属离子结合(如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂。疏水性层析法(1)蛋白质分子表面有部份疏水性区域，若在一极性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定相载体上；若环境的极性降低，则可被洗脱出来，即为疏水性层析法(hydrophobicinteractionchromatography,HIC)。(2)HIC没有亲和层析析法那么强的专一性，较似离子交换法，但所根据的作用力，则是

8、非极性基团间的疏水性引力。反相层析法(1)是HIC及离子交换法的综合体，但属于一种partit