比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性ctl对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用论文

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1、比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性CTL对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用论文张希国，师建国，刘彦仿，阎庆国【摘要】目的研究人外周血不同来源的树突状细胞（dendriticcells，DC）光镜形态学、细胞超微结构及体内外诱导抗肿瘤免疫反应的差异。方法联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白介素4（IL4）及肿瘤坏死因子（TNFα）从人外周血中培养出两类DC；人肝癌细胞系SMMC7721细胞的可溶性肿瘤抗原刺激两类DC；两类DC激活同源的T淋巴细胞；观察两类DC激活的T淋巴细胞分别抑制已接种于裸鼠的人肝癌细胞系S

2、MMC7721移植瘤生长。结果细胞因子诱导的人外周血DC群可见到两类DC亚群：一类可能来自DC前体细胞，另一类是由单核细胞分化来的DC；两类DC体外激活的T淋巴细胞能分别抑制肝癌细胞系SMMC7721裸鼠移植瘤生长。结论细胞因子诱导的人外周血DC群存在多相性，两类DC亚群体内外诱导的抗肿瘤细胞免疫反应不仅能抑制肝癌细胞系SMMC7721裸鼠移植瘤发生，而且抑瘤率不同.freelaTherapeuticalEffectofTumorSpecialCTLActivatedbyTa；Tumorimmunity；Anti

3、tumorvaccine树突细胞(dendriticcells,DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresentingcells,APC)，可以在体内外向T淋巴细胞提呈抗原，并诱发CTL(细胞毒T淋巴细胞)反应。选择人外周血体外培养富集DC是研究DC的重要途径，但所面临的困难是DC在外周血中含量极微，而且DC的多源性和多功能性尚待进一步阐明。本实验我们借助于细胞因子诱导体外培养富集人外周血含量达70%～80%DC群，经形态学鉴定为两种DC群。体外分别诱导出针对肝癌细胞抗原的特异性，并用于荷瘤裸鼠的治

4、疗以观察其抑瘤率的效果。1材料与方法1.1材料重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF），重组人白细胞介素4（rhIL4）、CD86(Sigma公司），重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）（校肿瘤研究所馈赠），淋巴细胞分离液（上海华精生物科技有限公司），RPMI1640、新生小牛血清（杭州四季青公司），MTT（华美生物工程公司），5周龄雌性BALB/c裸鼠中国科学院上海实验动物研究所，动物饲养及实验在校实验动物中心（SPF级动物实验室）完成，健康人外周血（附属医院输血科）。1.2方法1.2.1DC的体外培

5、养及收集据文献略作修改1，人外周血单个核细胞（PBMNC）以合适的密度接种于培养瓶内，适宜条件培养2h后收集未贴壁细胞（97%以上T淋巴细胞，收集另培养），继续培养24h后按3×106细胞/10ml培养瓶分组：将释放下来的悬浮细胞作为A组，仍然贴壁的细胞作为B组，A组及B组细胞均在含终浓度为500u/ml的rhGMCSF（1000u/ml）及rhIL4（500u/ml）的上述RPMI1640完全培养液中培养，A组及B组均于培养第3d向培养瓶中添加rhTNFα（终浓度500u/ml），每天半量换液，每隔3d全量换液（

6、含上述3种细胞因子的培养液），于培养第9d收集DC群。1.2.2两类DC亚群的透射电镜观察细胞超微结构于培养第12天收集足量A、B两组DC群,经PBS液洗2次后低速离心获细胞沉淀，经固定、脱水、包埋、超薄切片复染后，透射电镜观察并照相。1.2.3两类DC亚群活化的T淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤分别收集活化后的淋巴细胞，按每孔5×105、2.5×105、5×104做效应细胞，靶细胞分别为SMMC7721细胞、hepG2细胞。靶细胞浓度为每孔5×105。同时做效应细胞和每种靶细胞的对照各3复孔。效应细胞与靶细胞混合培养1

7、6h后加入5mg/mlMTT10μl继续培养8h。离心培养板（2000r/min，10min），弃去上清液，每孔加DMSO100μl，于570nm处测定A值计算各自实验结果。1.2.4荷瘤裸鼠模型的建立收集对数生长期的SMMC7721细胞，接种于裸鼠背部皮下，2×106/只，抑瘤率由治疗初始肿瘤重量治疗结束时肿瘤重量/治疗初始肿瘤重量来表示。1.2.5两类DC亚群诱导的肿瘤抗原特异性CTL治疗荷瘤裸鼠模型15只裸鼠中全部长出肿瘤。随机挑选5只荷瘤鼠为A群DC活化的肿瘤特异性CTL1治疗组，另选5只作为B群DC活化的肿

8、瘤特异性CTL2治疗组，最后5只为阴性对照组。1.2.6统计学方法实验结果采用SPSS统计软件进行方差分析。2结果2.1人外周血来源的两类DC亚群的形态特征观测在倒置显微镜下观察，A、B两组培养第3～4d时可见大部分细胞呈梭形，细胞表面呈毛刺状，细胞大小约为单核细胞的1～1.5倍，A、B两组细胞在数量及形态上无显著差