caspase┐3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡中作用论文

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1、Caspase┐3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡中作用论文.freelolAFC.freelolAFC，24h后为（0.754±0.056）nmolAFC，36h又下降到（0.486±0.033）nmolAFC，但都高于正常水平（P0.01）.加入特异性四肽抑制物DEVD-CHO1μL后活性为（0.040±0.003）nmolAFC，显著低于正常（P0.01）.结论Caspase-3参与了柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡，柔红霉素可使其活性增加.Keyentepithelium;cas-p

2、ase-3;apoptosisAbstract:AIMTostudythefunctionofcaspase-3activityduringdaunorubicininducedhumanretinalpigmentepitheli-umcellapoptosis.METHODSAfterbeingtreatedolL-1daunorubicinfor8，24and36h，theprimarycul-turedhumanretinalpigmentepitheliumcellsissioninetheact

3、ivityofcaspase-3indirectly.RESULTSThemeanactivityofthenormalgroupolAFC，andthoseofinducedgroupsolAFC，（0.754±0.056）nmolAFC，（0.486±0.033）nmolAFC，at8，24and36hrespectively.Theyalgroup（P0.01）Thefourpeptidesinhibitor-DEVD-CHOdecreasedtheactivityto（0.040±0.003）nmo

4、lAFC（P0.01）.CONCLUSIONCaspase-3isinvolvedindaunoru-bicininducedhumanretinalpigmentepitheliumcellapopto-sis，anddaunorubicincouldraisetheactivityofcaspase-3.近来研究发现，天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（caspases）与凋亡效应器、细胞色素C（CytC）和Bcl-2蛋白家族间相互作用，参与细胞凋亡的调控和执行，是影响细胞凋亡的重要因素.其中caspas

5、e-3在凋亡的执行阶段起作用［1］.以往的研究已经证实，柔红霉素可以诱导体外培养的人视网膜色素上皮（retinalpigmentepithelium，RPE）细胞发生凋亡，癌基因bcl-2和bax参与了对凋亡的调节［2-5］.但在此凋亡模型中有无caspase-3的参与尚未见文献报道，为此我们进行了以下实验.1材料和方法1.1材料DMEM培养基（Gibco公司），柔红霉素（意大利FarmirtaliaCarioErba），caspase-3荧光检测试剂盒（Clontech公司），胰蛋白酶（Gibco公司）.

6、用作者以往报道［4］中3～6代的细胞进行实验.1.2方法将RPE细胞传代接种于75mL培养瓶，待细胞长至约85%时，参照以往实验的条件［2］，加入浓度为200μgL-1的柔红霉素进行凋亡的诱导.实验分组如下:①抑制物组，即不加柔红霉素培养24h，样本处理中加入特异性抑制物DEVD-CHO;②正常对照组，即不加柔红霉素培养24h;③200μgL-1诱导8h;④200μgL-1诱导24h;⑤200μgL-1诱导36h.处理结束后参照试剂盒说明进行酶活力检测，具体程序如下:除正常对照组设5个平行管外，其余每组设4

7、个平行管，每管1×106个细胞;用50μL细胞裂解液裂解细胞，冰浴10min.细胞裂解物经8500g离心3min（4℃）后收集上清到另一离心管中;抑制物组，即加入2×反应缓冲液50μL（含4mmolL-1的DTT）和1μL的DEVD-CHO抑制剂到50μL上清，37℃水浴30min，然后进行步骤⑤;加入上述2×反应缓冲液50μL到其他各管;每管中加入1mmolL-1交联底物5μL，37℃水浴1h.正常培养细胞组中取出1管不加底物用于检测时仪器的调零;荧光比色检测仪检测，激发波长400nm，发射波长505nm

8、，读取数值.实验中采用倒置显微镜常规进行细胞形态的观察.Caspase-3活性单位的定量:①用细胞裂解缓冲液稀释80μmolL-1AFC（7-amino-4-trifluoromethylcoumarin，AFC），使终浓度分别为0，0.5，1，2和4μmolL-1;②用荧光检测仪测量以上5种浓度的液体，以AFC摩尔数为X轴，荧光单位（fluorescenceunits，FU）为Y轴，产生AFC标准曲线;③用以下