高糖对肝星状细胞增殖及对转化生长因子β1、血小板

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1、高糖对肝星状细胞增殖及对转化生长因子β1、血小板【摘要】　　目的研究高糖对肝星状细胞T6(HSCsT6)增殖及对转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生长因子(PDGF)及Ⅲ型前胶原(PCⅢ)表达的影响。方法设不同葡萄糖浓度组，观察30min～16h时间段，各组对HSCsT6分化、增殖的影响；并用免疫组织化学方法及放射免疫分析法在48、72h后测胞浆内TGFβ1、PDGF及细胞上清液中PCⅢ的表达。结果在2～16h，1500～6000mg/L浓度葡萄糖对HSCsT6增殖具有时间依赖性，而在4500～600

2、0mg/L浓度组更显著；同时在4500～6000mg/L浓度组，培养48h后胞浆中TGFβ1和PDGF表达较对照组和高渗对照组明显增加；培养72h后，细胞上清液中PCⅢ表达较对照组和高渗对照组明显增加。结论高血糖可能通过刺激HSCsT6分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ促进肝纤维化。【关键词】肝星状细胞；转化生长因子；血小板衍化生长因子；Ⅲ型前胶原　　ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofhighglucoseontheproliferationofhepaticstel

3、latecellT6(HSCT6)andtheexpressionsoftransformationgroin-16htimeperiod,andusedthemethodsofimmunohistochemistryandradioimmunoassaytomeasuretheexpressionsofTGFβ1,PDGFandPCⅢinthesupernatantat48hand72h.ResultsIn2-16htimeperiod,theproliferationofHSCein1500-6000mg/Lgr

4、oup,andorevisiblein4500-6000mg/Lgroup.TheexpressionsofTGFβ1andPDGFincreasedat48h,andtheexpressionofPCⅢinthesupernatantincreasedat72hin4500-6000mg/LgroupparedotehepaticfibrosisbystimulatingtheexpressionsofTGFβ1,PDGFandPCⅢinHSCT6.　　KEY)则被认为是非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfa

5、ttyliverdisease,NAFLD)的重要危险因素。临床研究表明，高血糖在NAFLD患者肝纤维化形成中起促进作用[12]。已证实高血糖能够诱导肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)中Ⅰ型胶原mRNA的表达，并诱导HSCs增殖[3]；其诱导HSCs活化、增殖可能通过依赖转化生长因子(transformationgroa公司；多聚赖氨酸购自美国Sigma公司；兔抗大鼠TGFβ1抗体及兔抗大鼠PDGFBB抗体购自北京中杉生物工程有限公司；PCⅢ放免试剂盒购自北京401研究所。　　1.2试验

6、分组　　A组(对照组)：葡萄糖1000mg/L剂量组；B组：葡萄糖1500mg/L剂量组；C组：葡萄糖3000mg/L剂量组；D组：葡萄糖4500mg/L剂量组；E组：葡萄糖6000mg/L剂量组；F组(高渗对照组)：甘露醇6000mg/L剂量组。　　1.3试验方法　　1.3.1细胞复苏及培养　　将冻存于液氮中的HSC取出迅速置37℃水浴解冻后移至超净台中，用移液管将细胞悬液移入离心管加入10倍以上普通DMEM(葡萄糖1000g/L)，1000r/min离心5min，除去上清液，加DMEM5mL，将细胞吹打为混悬液并移至无

7、菌培养瓶中置于5mL/LCO2细胞培养箱中培养至细胞贴壁。　　1.3.2MTT法检测细胞的增殖率　　HSCs细胞贴壁长至单层90%～95%时，2.5g/L胰蛋白酶消化，以普通的DMEM(含100mL/L小牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素及葡萄糖1000mg/L的培养液)调整细胞为1×105个/mL密度接种于96孔培养板，待HSCs细胞贴壁长至单层70%～80%时，换无血清的DMEM同步化细胞，每孔100μL继续培养24h。分别于培养结束前30min、1、2、4、8、16h加入A液、B液、C液、D液、E

8、液和F液，同时设空白对照组，每组设6个复孔，试验重复3次。培养24h后，每孔加入MTT20μL，37℃继续培养4h。终止培养后弃上清，每孔加入150μLDMSO溶解振荡，待结晶物充分溶解后(溶液呈蓝紫色)，置酶标仪上检测各孔吸光度值(表1)。　　1.3.3干预及细胞上清液的收集　　将含普通的DMEM调整