阻断stathmin基因高表达对成骨肉瘤细胞系的

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1、阻断Stathmin基因高表达对成骨肉瘤细胞系的【摘要】目的探讨Stathmin基因的反义核酸（AS-ODN）对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用。方法以高表达Stathmin的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607为靶细胞、反义Stathmin（AS-ODN）为阻断剂，通过MTT试验观察AS-ODN对成骨肉瘤细胞的生长抑制作用，流式细胞仪分析细胞增殖周期的影响。结果AS-ODN能明显抑制成骨肉瘤细胞的生长（P<0.05）.SOSP-9607在AS-ODN作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡。结论Stat

2、hmin基因的反义核酸（AS-ODN）对成骨肉瘤细胞的生长可能起十分重要的作用，它有望成为成骨肉瘤治疗的新靶点。【关键词】Stathmin基因；反义核酸；成骨肉瘤细胞【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinhibitionofAS-ODNofStathmingeneonculturedhumanosteosaracelllines.Methodsetablastin）为一种高度保守的细胞内蛋白。TT试验（测定AS-ODN对SOSP-9607细胞生长的抑制作用）取对数生长期的SOSP-96

3、07细胞，调节细胞密度为5×104/ml，各取0.2ml加入96孔板中，分别标记正义组、反义组。正义组和反义组分别加入终浓度均为20μmol/L的S-ODN和AS-ODN。每组设3个复孔，培养后1、2、3、4进行台盼蓝染色细胞计数，计算生长抑制率［（对照组细胞数-处理组细胞数）/对照组细胞数］。1.2.2流式细胞仪分析流式细胞仪（FCM）分析采用Nicolletti氏法。将终浓度为20μmol/L的S-ODN和AS-ODN与SOSP-9607细胞共同培养3天后，离心，去培养液，DBS洗涤2次，0.2mlPBS重悬SOSP

4、-9607细胞，用吸管快速吹打进预冷的700mL/L乙醇中，4℃保存，检测前离心去乙醇，碘化丙啶染色15min，上机检测。所用流式细胞仪为EpicsElite（美国），汞激光激发波长为488nm。结果分析软件为Elite4.0和DNAMultictycle。1.3统计学处理数据以x±s表示，差异显著性采用t、χ2检验。2结果与正义组相比，反义组对SOSP-9607细胞生长具有明显的抑制作用，差异有显著性（P<0.05），见表1和图1；反义组抑制率明显高于正义组（P<0.05），见表2和图2。表1不同时间药物对

5、SOSP-9607细胞生长的影响（略）注：Vscontrol，P<0.05表2S-ODN、AS-ODN对SOSP-9607细胞生长抑制率的比较（略）细胞生长抑制率的比较细胞周期分布分析：AS-ODN（20μmol/L）处理细胞3h后，可见细胞G2/M期百分比增高；至48h，G2/M期百分比达55.5%。亚二倍体峰（Sub-G1）表示DNA降解，又称细胞凋亡峰;在72h，Sub-G1期细胞占9.2%，提示细胞凋亡发生。见表3。S-ODN（20μmol/L）处理组未见出现亚二倍体峰。表3AS-ODN（20μmol/L）

6、处理SOSP-9607细胞不同时间的DNA含量分析（略）3讨论反义基因疗法是目前肿瘤基因治疗中的一个重要方面，它是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，以其阻断瘤细胞内的异常传导信号，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡［6］。成骨肉瘤是常见的恶性骨肿瘤，预后较差。目前对于成骨肉瘤的基础研究及临床治疗仍是当今医学领域热点之一。研究表明，Stathmin是从淋巴瘤中筛选出的特征性的表达基因［7～9］，为一种高度保守的细胞内蛋白，在细胞周期过程中可被蛋白激酶磷酸化，阻断Stathmin磷酸化将使细胞分裂停止于

7、G2/M期［4］。细胞内微管相关蛋白磷酸化过程中Stathmin是重要调节因子［10］，影响细胞分裂及增殖。笔者应用RT-PCR方法首次在成骨肉瘤细胞中检测到Stathmin高表达（见图3），在此基础上利用反义核酸技术、抑制其表达，其活性被封闭后，SOSP-9607细胞的增殖出现障碍，说明Stathmin基因在维持SOSP-9607细胞的生长中起十分重要的作用。从表1、图1和表2、图2可看出，AS-ODN具有抑制SOSP-9607细胞生长的作用，而S-ODN无此作用。Lane1:PCRMarker；Lane2:K562细

8、胞为阳性对照；Lane3:人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞,可见480bp基因条带。图3RT-PCR检测人成骨肉瘤细胞中Stathmin表达细胞周期分布分析，AS-ODN作用后首先表现为G2/M期的阻滞，在G1峰前出现凋亡小峰（AP峰）随后G2/M逐渐减少，AP逐渐增多。AP峰的出现表明细胞DNA降解、渗漏，导