线粒体功能障碍在高糖刺激的小鼠足细胞凋亡中的作用

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1、线粒体功能障碍在高糖刺激的小鼠足细胞凋亡中的作用河北省任丘市华北石油管理局总医院肾内科河北任丘062552)【摘要】目的：观察高糖培养的小鼠肾脏足细胞中凋亡发生的情况，探讨传统线粒体凋亡途径在糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡发生中的可能作用，以便更深入的了解糖尿病肾损伤的潜在分子机制。方法：常规培养小鼠足细胞，将分化成熟的足细胞经无血清培养基同步化12h后分为分成2组：正常糖对照组(NG):D-葡萄糖lg/L;高糖刺激组(HG):D-葡萄糖4.5g/L，分组干预刺激24h、48h、72h,透射电镜观察细胞超微结构改变；TUNEL法及流式细胞术检测细胞

2、凋亡；流式细胞术检测线粒体跨膜电位;免疫细胞化学和Westernblot检测足细胞中Caspase-3蛋白的表达变化；Westernblot检测CytochromeC蛋白的表达变化。结果：1、透射电镜结果显示，正常足细胞结构完整，足突形态细长、规则，基底膜无明显增厚，可见少许微绒毛、细小突起。高糖组肾小球基底膜不规则增厚，部分足突增宽、融合，近曲小管上皮细胞内可见空泡，线粒体部分嵴消失；2、流式细胞术及TUNEL法结果均显示：高糖刺激组较正常对照组细胞凋亡数显著升高；3、高糖培养组较正常对照组足细胞线粒体膜电位明显下降；4、免疫组化结果：高糖

3、培养组细胞内Caspase-3蛋白表达明显增强，正常糖对照组仅有少量阳性表达;5、Westernblot结果:高糖培养组CytochromeC、Caspase-3表达较正常对照组增高。结论：高糖刺激的足细胞线粒体膜电位明显下降，释放到胞质中的CytochromeC增高，Caspase-3表达上调，提示高糖刺激引起了＞51细胞中线粒体功能障碍，其相关凋亡途径可能参与了足细胞的凋亡过程，并在DN的发生和发展中起着关键作用。【关键词】糖尿病肾病；线粒体功能障碍；足细胞；高糖；线粒体膜电位【中图分类号】R318【文献标识码】B【文章编号】1764_8

4、999(2015)7-0799-02并发症之-。足细胞是肾小球滤过屏障的重要成分，在维持肾小球通透性、抵抗毛细血管内的静水压、维持毛细血管襻的结构稳定等方面发挥重要作用。大量研究证实，足细胞损伤是DN发病的启动机制之一，损伤后的足细胞数量减少在肾小球硬化的发生过程中起着关键性的作用。凋亡是导致足细胞丢失的重要因素，在DN的发病机制中起着关键作用。本实验模拟体内高糖环境，观察不冋吋间点体外培养的小鼠足细胞的凋亡情况，并通过检测线粒体膜电位以及相关凋亡因子caspase-3、Cyt-c的表达变化，探讨线粒体功能障碍在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用。

5、1材料与方法1.1足细胞培养、传代及冻存1.1.1足细胞培养将冻存足细胞在37°C水浴中复苏后移入培养瓶，加入含10%胎牛血清的1640培养液，置于33°C、5%CO2培养箱中孵育使其增殖；相差显微镜观察细胞形态，细胞成熟分化后可用于实验。1.1.2细胞传代将足细胞培养液以胰蛋白酶-EDTA法洗涤、消化后，高速离心,按所需的接种密度接种于培养瓶。1.1.3细胞冻存以33°C培养的增殖态足细胞按照4°C30min、-20°C30-60min、-80°C过夜、液氮罐长期保存的顺序进行冻存。1.2细胞实验分组将实验细胞分成2组：正常糖对照组(NG)

6、:D-葡萄糖lg/L;高糖培养组(HG)：D-葡萄糖4.5g/L,分别经细胞同步化、分组干预刺激24、48、72h后收集细胞及上清液，进行相关指标的检测。1.3透射电镜观察足细胞形态学改变收集细胞干预72h后的足细胞，PBS冲洗,1000r/min离心5min，使细胞成团，小心吸取上清，加入2.5%戊二醛固定，包埋，超薄切片，透射电镜观察NG、HG组细胞的超微结构改变。1.4方法1.4.1分别采用TUNEL法、流式细胞术检测细胞凋亡1.4.2免疫细胞化学检测足细胞中Caspase-3蛋白的表达1.4.3Westernblot检测Cyt-c、C

7、aspase-3蛋白的表达1.4.4流式细胞术检测线粒体跨膜电位（mitochondrialtranmembranepitentials，ΔΨm）收集刺激后24、48、72h细胞,制成l-2×106/ml细胞悬液，加入Rhl23探针，避光孵育lOmin，离心（lOOOrpm，4min）,在流式细胞仪上检测荧光强度，激发波长为470-490nm，发射波长为515-565nm。1.5统计学处理所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行分析。计量资料以均数&pluSmn;标准差（＞表示；组间不冋吋间点的比较采用析因设

8、计的方差分析，两两比较采用LSD方法分析。统计结果以P<0.05为显著性差异判断标准。2结果2.1足细胞的形态学特征透射电镜观察，正常足细胞结构完整，足突形态