pafah基因多态性与1型糖尿病的相关性

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　　PAFAH基因多态性与1型糖尿病的相关性【摘要】　　目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶（PAFAH）基因G994T和G275A多态性及血浆PAFAH水平与1型糖尿病的相关性。方法选择115例1型糖尿病病人(T1DM组)和106例正常对照者（CON组）作为研究对象,采用PCRRFLP和特异性引物方法测定PAFAH基因G994T和G275A多态性，采用酶水解底物显色法测定血浆PAFAH水平。结果T1DM组G275A位点GA基因型频率显著高于CON组（χ2=4.667，P<0.05）,A等位基因频率两组差异无显著性（χ2=1.976，P>0.05）。TIDM组G994T位点T等位基因频率和GT基因型频率与CON组比较差异无显著性(χ2=0.148、0.072,P>0.05)。与CON组相比，T1DM组PAFAH活性均明显降低（P=0.00003）。结论PAFAH基因275G→A的点突变可能与1型糖尿病相关。【关键词】1烷基2乙酰甘油磷酸胆碱酯酶糖尿病1型基因型　　［ABSTRACT］ObjectiveTostudytherelationshipbetorphismofPAFAHgene,plasmaPAFAHlevelandtype1diabetesmellitus(T1DM).MethodsThisstudyconsistedof115patientser method.ActivityofplasmaPAFAHinallpatientsandcontrolsinedbyPAFAHAssaykit.ResultsThefrequenciesofGAgenotypeonG275Apolymorphism(χ2=1.976,P>0.05).ThefrequenciesofTalleleandGTgenotypeonG994TpolymorphismbetaPAFAHinT1DMutationofPAFAHgenemayberelatedtotype1diabebesmellitus.　　［KEYSO0.5μL,2.5μmol/L上下游引物各1μL;2.5×106U/LTaqDNA聚合酶0.3μL,基因组DNA模板1μL(25ng)；加双蒸水补充至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min,然后94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s，循环35次后72℃末次延伸10min。在总体积15μL酶切反应体系中加入PCR产物8μL,BclⅠ酶5U,55℃消化1h。取酶切产物10μL上样于30g/L的琼脂糖凝胶电泳，于紫外线灯下观察结果并拍照，记录基因型。野生型282bp的PCR产物中不存在BclⅠ的识别序列，故酶切后只有一条282bpDNA片段者为野生型（GG纯合型）。但G→A突变后的个体存在TGATCA识别序列，可以被BclⅠ切开，故有282、113、169bp等3条带者为突变杂合子（GA杂合型）。随机选择酶切证实野生型和杂合突变型标本PCR产物各两份测序证实酶切结果。② G994T位点：引物序列为上游A5′CTATAATTTATATCATGCTT3′，下游B5′TTTACTATTCTCTTGCTTTAG3′，下游C5′CTATAATTTATATCATGCTT3′,下游D5′TCACTAAGAGTCTGAATAAC3′。AB引物扩增片段的长度为160bp，AC、AD引物扩增片段长度均为108bp。反应体系：总体积为20μL，内含10×PCR缓冲液2μL,10mmol/LdNTP0.5μL,2.5μmol/L上下游引物各1μL;2.5×106U/uLTaqDNA聚合酶0.3μL,基因组DNA模板1μL(25ng)；加入双蒸馏水补充至20μL。PCR扩增反应条件：采用Touchdoin；94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，循环5次；94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10min。每一样本针对不同的特异性引物作3个PCR反应，其中引物A和B特异性扩增G994T位点所在的第9外显子的全长，引物A和C扩增野生型目的片段，引物A和D扩增突变型目的片段。只在野生型泳道108bp部位出现电泳条带的基因型为野生型纯合子GG;同时在野生型泳道108bp和突变型泳道108bp部位出现电泳条带的基因型为突变杂合子（GT杂合型）。随机选择部分野生型和突变型个体的第9外显子PCR产物测序，证实分型结果。　　1.2.3PAFAH活性测定 采用酶水解底物显色法，按试剂盒说明操作,试剂盒购自美国CaymanChemical公司。　　1.3统计学处理　　采用SPSS11.5软件进行数据处理,计量资料用±s表示，数据间比较采用t检验；计数资料比较用χ2检验。　　2结果　　2.1两组血浆PAFAH活性比较　　1型糖尿病组病人PAFAH活性为（0.015±0.006）mmol/（min·L）,正常对照组为（0.021±0.012）mmol/（min·L），两组比较，差异有显著性（P=0.00003）。　　2.2各组等位基因频率及基因型频率比较　　1型糖尿病组G275A位点GA基因型频率明显高于正常对照组（χ2=4.667，P<0.05），A等位基因频率与正常对照组比较差异无显著意义（χ2=1.976，P>0.05),两组中均未发现AA纯合突变型。两组G994T位点T等位基因频率和GT基因型频率比较差异无显著性(χ2=0.148、0.072,P>0.05)，两组中均没发现TT纯合突变型。见表1。　　表1两组基因型频率和等位基因频率比较（略）　　3讨论 　　本研究结果显示，山东汉族人群中G275A位点GA基因型在1型糖尿病病人中出现频率显著增高,提示GA基因型可能是1型糖尿病的危险因素。G275A位点位于第4外显子，该SNPs的存在引起PAFAH蛋白质中第92位氨基酸Arg→His突变，这种突变改变了PAFAH的酶动力学性质，降低酶的底物亲和力，延长了PAF发挥作用的时间[3]，间接地增强了PAF的病理作用，从而导致了PAFAH酶活性的明显降低。BELL等[2]在英国精神分裂症人群和正常对照人群该位点各发现5%的纯合突变型。但本研究无论在正常人群还是在1型糖尿病病人中均未发现纯合型突变个体,提示该位点可能存在种族差异。　　PAF是一种具有多种生物学功能的磷脂，参与促炎症反应细胞如血小板、中性粒细胞、巨噬细胞的信号转导和活化，抑制B细胞的凋亡。因此，PAF参与多种炎症疾病和变态反应性疾病的发生和发展。PAFAH是PAF主要代谢酶，特异性作用于PAF甘油骨架的sn2位乙酰基，将其水解为无活性lysoPAF。人类PAFAH基因位于第6染色体6p21.2p12，该区域通常被认为是1型糖尿病主要易感基因——人类白细胞抗原（HLA）所在区域。 　　1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，与T淋巴细胞和巨噬细胞活化导致单核细胞浸润有关。在1型糖尿病的前临床阶段——胰岛素炎阶段，粒细胞包绕并浸润胰岛朗罕细胞，血浆中IL6和TNFα水平均有明显增高[4]，提示炎症免疫应答被激活。SANKARANAND等[5]在1型糖尿病小鼠中发现编码炎症细胞因子的基因转录水平增高，编码细胞聚集、归巢和凋亡相关的基因也明显上调。PAFAH水平升高可减轻PAF介导的上述炎症递质效应。此外，国内外研究证明，儿童和青少年1型糖尿病病人中存在氧化和抗氧化失衡，氧化应激增强。氧自由基介导的脂质过氧化反应和细胞毒素乙醛都导致细胞因子对胰岛β细胞的损伤。脂质过氧化产物还可以导致血管收缩和血小板黏附聚集，是引起动脉粥样硬化、高血压、糖尿病肾病等1型糖尿病并发症的主要原因。研究结果还表明，随着病程的延长，1型糖尿病病人三酰甘油、总胆固醇水平逐渐增高[6]。PAFAH可阻止低程度氧化的LDL分子体外形成及其细胞内摄取，因此在氧化过程中起重要的保护作用。由此可见，PAFAH酶活性降低可能影响Ⅰ 型糖尿病及其慢性并发症的发生和发展。由于G275A位点或G994T位点纯合突变可导致酶活性完全丧失，因此我们推测上述纯合突变可能是1型糖尿病及其血管并发症的重要易感因素。但本研究未检测到纯合突变基因型，可能与样本量少及国家、民族的差异有关。虽然本研究所选取的人群存在地域分布的局限性，但中国汉族人群相对均一性较好,遗传背景基本相同。尽管如此，也应在不同地域的人群中进行类似研究，以消除地域偏倚，同时也应在家族连锁不平衡研究中寻找更多的证据。　　综上所述，中国北方汉族1型糖尿病病人血浆PAFAH活性明显低下，PAFAHG275A可能是导致PAFAH活性低下的内在原因之一，与1型糖尿病有关。PAFAH作为体内调节血浆PAF的主要因子，除与自身免疫性疾病的发生、发展有关外，与动脉粥样硬化性疾病，特别是糖尿病大血管和微血管并发症也可能存在关联。对此进行深入研究，对揭示糖尿病血管并发症发病机制，开发新的治疗药物有重要意义。【