资源描述:
《pafah基因多态性与1型糖尿病的相关性》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、PAFAH基因多态性与1型糖尿病的相关性【摘要】 目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶(PAFAH)基因G994T和G275A多态性及血浆PAFAH水平与1型糖尿病的相关性。方法选择115例1型糖尿病病人(T1DM组)和106例正常对照者(CON组)作为研究对象,采用PCRRFLP和特异性引物方法测定PAFAH基因G994T和G275A多态性,采用酶水解底物显色法测定血浆PAFAH水平。结果T1DM组G275A位点GA基因型频率显著高于CON组(χ2=4.667,P<0.05),A等位基因频率两组差异无显著性(χ2=1.
2、976,P>0.05)。TIDM组G994T位点T等位基因频率和GT基因型频率与CON组比较差异无显著性(χ2=0.148、0.072,P>0.05)。与CON组相比,T1DM组PAFAH活性均明显降低(P=0.00003)。结论PAFAH基因275G→A的点突变可能与1型糖尿病相关。【关键词】1烷基2乙酰甘油磷酸胆碱酯酶糖尿病1型基因型 [ABSTRACT]ObjectiveTostudytherelationshipbetorphismofPAFAHgene,plasmaPAFAHlevelandtype
3、1diabetesmellitus(T1DM).MethodsThisstudyconsistedof115patientsermethod.ActivityofplasmaPAFAHinallpatientsandcontrolsinedbyPAFAHAssaykit.ResultsThefrequenciesofGAgenotypeonG275Apolymorphism(χ2=1.976,P>0.05).ThefrequenciesofTalleleandGTgenotypeonG994Tpolymorphismbet
4、aPAFAHinT1DMutationofPAFAHgenemayberelatedtotype1diabebesmellitus. [KEYSO0.5μL,2.5μmol/L上下游引物各1μL;2.5×106U/LTaqDNA聚合酶0.3μL,基因组DNA模板1μL(25ng);加双蒸水补充至20μL。PCR反应条件:94℃预变性5min,然后94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次后72℃末次延伸10min。在总体积15μL酶切反应体系中加入PCR产物8μL,BclⅠ酶5U,55℃消化1h。取酶切产物
5、10μL上样于30g/L的琼脂糖凝胶电泳,于紫外线灯下观察结果并拍照,记录基因型。野生型282bp的PCR产物中不存在BclⅠ的识别序列,故酶切后只有一条282bpDNA片段者为野生型(GG纯合型)。但G→A突变后的个体存在TGATCA识别序列,可以被BclⅠ切开,故有282、113、169bp等3条带者为突变杂合子(GA杂合型)。随机选择酶切证实野生型和杂合突变型标本PCR产物各两份测序证实酶切结果。②G994T位点:引物序列为上游A5′CTATAATTTATATCATGCTT3′,下游B5′TTTACTATTCTCTTG
6、CTTTAG3′,下游C5′CTATAATTTATATCATGCTT3′,下游D5′TCACTAAGAGTCTGAATAAC3′。AB引物扩增片段的长度为160bp,AC、AD引物扩增片段长度均为108bp。反应体系:总体积为20μL,内含10×PCR缓冲液2μL,10mmol/LdNTP0.5μL,2.5μmol/L上下游引物各1μL;2.5×106U/uLTaqDNA聚合酶0.3μL,基因组DNA模板1μL(25ng);加入双蒸馏水补充至20μL。PCR扩增反应条件:采用Touchdoin;94℃变性30s,56℃退火
7、30s,72℃延伸30s,循环5次;94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,循环30次;最后72℃延伸10min。每一样本针对不同的特异性引物作3个PCR反应,其中引物A和B特异性扩增G994T位点所在的第9外显子的全长,引物A和C扩增野生型目的片段,引物A和D扩增突变型目的片段。只在野生型泳道108bp部位出现电泳条带的基因型为野生型纯合子GG;同时在野生型泳道108bp和突变型泳道108bp部位出现电泳条带的基因型为突变杂合子(GT杂合型)。随机选择部分野生型和突变型个体的第9外显子PCR产物测序,证实分型结果。
8、1.2.3PAFAH活性测定采用酶水解底物显色法,按试剂盒说明操作,试剂盒购自美国CaymanChemical公司。 1.3统计学处理 采用SPSS11.5软件进行数据处理,计量资料用±s表示,数据间比较采用t检验