脑组织中rantes表达在急性胰腺炎血脑屏障通透性变化中的作用

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1、华中科技大学硕士学位论文（1）PCR试剂：TRIzol试剂（Sigama公司，保存于4℃）、RANTES，occludin及β-actin引物（上海英骏生物技术有限公司）、RT-PCR试剂盒（购于Promega公司，保存于－20℃）、2×TaqPCRMasterMix，Marker（购自北京天根生物技术公司）。（2）Western-blot试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/LTBS(pH7.3)、12％分离胶、5％浓缩胶、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2×（5×）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、10×丽

2、春红染液、TBS、TBST、化学发光试剂、显影液、定影液、(3)牛磺胆酸钠（美国Sigma公司），occludin兔抗鼠一抗(美国Zymed公司)和Western-blot用RANTES兔抗鼠一抗（美国Biovision公司)，免疫组化用RANTES兔抗鼠一抗（武汉博士德公司产品）及兔源二抗（北京中杉金桥）。1.4溶液配置1.4.1、RT-PCR有关溶液及试剂配制（1）无RNase水的配制：抽取蒸馏水注入无RNase的玻璃瓶中，加DEPC至体积比为0.01%，高压蒸汽灭菌。（2）0.1%DEPC水的配制：将三蒸水：DEPC按500ml：500ul的比

3、例配制，高压蒸汽灭菌。（3）75%乙醇的配制：将无水乙醇：0.1%DEPC水按3ml：1ml的比例配制。即75ml无水乙醇加25ml0.1%DEPC。（4）琼脂糖凝胶（1.5%）的制备：1.5g琼脂糖粉+100mlTAE，微波中火煮沸3次，不烫手时加6ulGoldenview，将凝胶溶液倒入胶板铺板，室温下待凝胶完全凝固，拔出梳齿，将带凝胶胶板放入电泳槽中。1.5.2、Western-blot有关溶液及试剂配制（1）G250考马斯亮蓝溶液的配制：考马斯亮蓝G250100mg，95％乙醇50ml，磷酸100ml，加蒸馏水至1000ml，混匀，用滤纸过滤

4、，4℃保存。（2）100mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的配制：BSA0.1g溶于0.15mol/LNaCl1ml，6华中科技大学硕士学位论文-20℃保存，制作蛋白曲线时，用0.15mol/LNaCl稀释成1mg/ml使用。（3）12％分离胶和5％浓缩胶的配制：分离胶（15ml）成分：ddH2O4.8ml,30%Arg6.0ml,Tris-HCl(pH8.8)3.9ml,10%SDS0.15ml,10%过硫酸胺（AP）0.15ml,TEMED0.016ml；浓缩胶(5ml)成分：ddH2O3.4ml,30%Arg0.83ml,Tris-HCl(pH6

5、.8)0.63ml,10%SDS0.05ml,10%AP0.05ml,TEMED0.005ml。（4）还原型5×SDS上样缓冲液的配制：0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)2.5ml，二硫叔糖醇（DTT）0.39g，溴酚蓝0.025，甘油2.5ml，混匀后4℃保存。（5）电泳缓冲液的配制：Tris3.03g，甘氨酸18.77g，SDS1g，加蒸馏水至1000ml，溶解后室温保存。（6）转移缓冲液的配制：Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1g，甲醇200ml，加蒸馏水至1000ml，溶解后室温保存。（7）TBS缓冲液的配制：Tris-HC

6、l(pH7.5)10ml，NaCl8.8g，加蒸馏水至1000ml。（8）TBST缓冲液的配制：Tris2.422g，NaCl8.775g，Tween200.5ml，加蒸馏水至1000ml。（9）封闭液配制：脱脂奶粉5g，TBST100ml，现用现配。（10）10X丽春红染液：丽春红S2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加蒸馏水至100ml。2方法1.4.1急性胰腺炎模型制备术前12小时禁食，自由饮水。采用1%戊巴比妥钠（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉。上腹正中切口进入腹腔，显露胰胆管，以血管夹阻断近肝门处胰胆管后，用4号头皮静脉针于十二指肠

7、乳头附近经十二指肠壁穿刺，逆行插入胰胆管，在十二指肠乳头处用血管夹夹闭胆总管末端。参照许永春[11]等方法制备急性轻重症胰腺炎模型,轻症胰腺炎将0.5%牛磺胆酸钠溶液(0.24ml／min)注入胰胆管，剂量为lml／kg，重症胰腺炎则改为5％。两分钟后松开血管夹拔针剂，双层关腹。1.4.2假手术组开腹后不进行插管，仅仅翻动胰腺，其余步骤同上。7华中科技大学硕士学位论文1.4标本采集大鼠处死后取胰腺组织，用4%的多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色并由专业的病理医师阅片，评分系统采取许永春等[12]报导的方法，根据胰腺水肿、白细胞浸润、出血和坏

8、死的情况进行评分，每项分四个等级分别给予1，2，3，4分，满分为16分。表1急性胰腺炎病理学评分病理分级评分