大蒜多糖中单糖组分的毛细管电泳研究.doc

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1、大蒜多糖中单糖组分的毛细管电泳研宄作者：马晓丽，孟磊，孙莲，李新霞，吕成军【摘要】目的建立高效毛细管电泳法分析大蒜多糖中的单糖组成及摩尔比。方法大蒜多糖样品经2mol/L硫酸降解为单糖后，经H苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化，用毛细管区带电泳(CZE)法测定单糖组成。结果大蒜多糖中葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醒酸、半乳糖的摩尔比为：：：：：：。结论该方法灵敏度高，结果准确可靠，可用于大蒜多糖的单糖组成测定及质量控制。【关键词】大蒜多糖；衍生化；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；毛细管电泳法大蒜(Alliumsati

2、vum)营养丰富，是日常生活中常用的香辛蔬菜和调味佳品，而且具有很强的防病治病保健功能［1］。大蒜多糖为大蒜中一类含量较高的活性组分，药理研究证明大蒜多糖具有抗氧化、抗病毒、保护心肌、防止心肌纤维化等多种重要的生物活性［2,3］，虽然大量文献报道了大蒜多糖的提取分离及药理作用，但关于大蒜多糖的单糖组分研究未见报道。高效毛细管电泳法［4，5］是近年发展起来的一种具有高效、灵敏和低耗的分析方法，已引起药物分析界的广泛重视。本实验首次采用柱前衍生化方法，用毛细管电泳法研究大蒜多糖的单糖组成，以期为大蒜资源的开发和利用提供基础依据。1仪器与试药Beckman

3、P/ACETMMDQ型高效毛细管电泳仪，二极管阵列检测器，石英毛细管柱；FE20-pH计；XS205电子天平。葡萄糖（glucose）、甘露糖（mannose）、半乳糖（galactose）、鼠李糖（rhamnose）、阿拉伯糖（arabonose）（分析纯，上海试剂二厂）；葡萄糖酸酸（glucuronic）和半乳糖醒酸（galacturonicacid，分析纯，Sigma公司）；大蒜多糖由新疆埃乐欣药业分离纯化。卜苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）;乙腈，甲醇，色谱纯；硫酸，盐酸，氢氧化钠（分析纯，西安化学试剂厂）；水为去离子水。2方法与结果电

4、泳条件石英毛细管柱；运行缓冲液：75mmol•L-1硼砂溶液；柱温25°C;电压：15kV;压力进样PaX20s;检测波长245nm。清洗程序：第1次进样前分别以甲醇、双蒸水、mol/L盐酸、双蒸水、mol/LNa0H、双蒸水、缓冲溶液冲洗毛细管20psiX3min;每变换1次电泳缓冲液，均用缓冲液平衡至电流平稳（10min）后才能进样测量。样品及缓冲液均在4°C储存，在使用前用um微孔滤膜滤过，且临用前超声脱气处理。多糖的水解精确称取大蒜多糖mg，置于10ml具塞试管内，加入2mol*L-1的H2S04溶液ml,于100°C水浴中水解8h,得水解样

5、品溶液。用4mol•L-1氢氧化钠水溶液中和至pH,并以纯化水稀释到ml,离心，吸取上清液，得多糖水解样品。衍生物的制备标准单糖混合液的配制分别精密称取甘露糖8g及半乳糖6g，鼠李糖6g，葡萄糖9g，葡萄糖醛酸9g，半乳糖醛酸2g，阿拉伯糖0g，置10ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得。标准单糖混合液的衍生精密吸取单糖混合液50P1，于具塞试管中，分别加入mo1•L-lNaOH5Oy1和mol•L-1PMP甲醇溶液50ul，涡旋混合30s，置于70°C水浴反应30min,冷却至室温，加入mol•L-lHC150yl进行中和，加入去离子水10

6、0P1稀释混匀，然后加入1ml氯仿洞漩混匀30s,静置5min，上层水相再重复萃取2次，经Pm微孔滤膜滤过，进样分析。多糖水解样品的衍生将水解后的大蒜多糖按“”项下方法进行衍生化处理，进样时间20s。结果见图1〜2。线性关系考察取适量标准品混合液按“”项方法进行衍生，经Pm微孔滤膜滤过，用过滤过的去离子水1:1稀释，分别进样，，，，s，记录色谱图，进行线性回归。结果见表1。表17种单糖的标准曲线进样精密度考察考察所建立方法在相同操作条件下短时间内的精密度：衍生化后，在上述色谱条件下，连续5次重复进样分析。葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、

7、葡萄糖醛酸、半乳糖的峰面积的进样精密度（RSD，n=5）分别为％，％，％，％，％，％，％。加样回收率取已知含量的多糖水解样品，定量加入单糖混合对照品，以“”进行衍生化，重复测定6次，测得吸收峰面积，计算回收率。结果见表2。表2回收率测定结果多糖样品分析精确称取大蒜多糖依“”“”项下方法进行操作，将混合单糖标准品图谱与大蒜多糖的图谱对照，采用校正因子计算单糖组成比例，样品可不加内标进行衍生化HPCE分析。根据分析和计算方法，求得大蒜多糖中葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖物质的量之比为:3讨论衍生化除了糖醛酸外，其他中性糖

8、的电离能力非常弱，它们的PMP衍生物电离能力也非常弱，但单糖属于多羟基化合物，能和硼酸根形成带负电荷的络离子