人酪氨酸酶相关蛋白┐2的cdna克隆及表达

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1、人酪氨酸酶相关蛋白┐2的cDNA克隆及表达摘要:目的克隆酪氨酸酶相关蛋白-2（TRP-2）编码基因，表达TRP-2蛋白.方法从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP-2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP-2/GST融合蛋白.结果从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP-2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致;成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/

2、TRP-2;表达了TRP-2/GST融合蛋白.结论成功克隆了人TRP-2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP-2/GST融合蛋白.　　Keyantyrosinasere-latedprotein2（TRP-2）andexpressthecorrespondingpro┐tein.METHODSTotalRNAculturedhu-manpigmentalcellsandmRNAplifytheTRP-2codingre-gion.ThePCRproductidandsequenced，thens

3、ubclonedintovectorpGEX-4T-1.TheTRP-2proteined;FusionexpressingvectorofpGEX-4T-1/TRP-2anTRP-2geneissuccessfullyclonedandTRP-2/GSTfusionexpressingvectorisconstructed.TRP-2/GSTfusionproteiniscorrectlyexpressedinE.coli.　　0引言　　酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinaserelatedpro-

4、tein-2，TRP-2）DHI-2羧酸转化过程中发挥作用.TRP-2是一种胞质抗原与白癜风的病理机制有关，在白癜风、恶性黑素瘤及接受特异性免疫治疗而产生色素减退的患者血清中抗TRP-2IgG滴度较高.此外，抗TRP-2自身抗体与TRP-2或酪氨酸酶均可发生反应，即TRP-2与酪氨酸酶为交叉抗原.因此，克隆并翻译TRP-2的cDNA序列，可为进一步探索酪氨酸酶与TRP-2的交叉抗原表位及白癜风的发病机制和治疗打下基础.　　1材料和方法　　1.1材料人黑素细胞系、克隆质粒pUC19、表达质粒pGEX-4T

5、-1和菌株DH5α由第四军医大学西京医院皮肤科实验室保存;总RNA提取试剂盒购于华美公司;BamHI，EcoRI，T4DNA连接酶购于TaKaRa公司;TaqDNA聚合酶，反转录试剂盒、胶回收试剂盒购于Promega公司;谷胱甘肽巯基转移酶（GST）纯化试剂盒购于CloneTech公司.　　1.2方法根据载体多克隆酶切位点及TRP-2的序列，设计引物.其中引物5’端中引入BamHI酶切位点，3’端引入EcoRI酶切位点.引物由北京SBS公司合成，引物的序列为（下划线为酶切位点）:p15’CG---GGA

6、TCC---ATGGGCTATAATTGTGGAGACTGCA3’p25’CG---GAATTC---GGCAAAGTTCCAGTAGGGCAAA3’;　　按试剂盒说明书方法操作，从培养的人黑素细胞中提取总RNA，将mRNA反转录合成cDNA.目的基因片段常规PCR扩增，反应条件为:95℃预变性2min后加入TaqDNA聚合酶1U，按94℃30s，55℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后在72℃延伸10min.以HPV重组质粒为反应体系的阳性对照，三蒸水为空白对照，以TRP-1重组质粒为阴性对照

7、.PCR产物进行12g・L-1琼脂糖电泳，检测扩增产物片段的大小.产物经回收后，以BamHI，EcoRI双酶切，回收目的片段后定向插入经同样双酶切的pUC19载体中，以T4DNA连接酶连接.重组后的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒后以BamHI，EcoRI双酶切，12g・L-1琼脂糖电泳鉴定.重组质粒由上海生工生物工程公司完成测序.目的基因片段的亚克隆:将测序后的重组载体以BamHI，EcoRI双酶切，切下的片段插入经同样双酶切的pGEX4T-1载体中，转化感受态细胞

8、DH5α.TRP-2与GST融合蛋白的诱导表达:加入终浓度为0.4mmol・L-1的IPTG，于37℃分别诱导培养2，3和4h，按常规方法收菌，进行SDS-PAGE.用薄层扫描仪分析该蛋白占菌体总蛋白的含量［1］.表达蛋白的可溶性鉴定:以超声波破碎细胞，收集表达菌体后，分别取相同浓度的50μL上清及沉淀，进行SDS-PAGE，观察表达条带是在上清中还是在包涵体中.表达蛋白的纯化用Clotech公司的GST融合蛋白纯化柱，按操作