黑松银松素合成酶的cDNA克隆及表达研究.pdf

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1、第29卷第2期青岛大学学报(工程技术版)Vo1．29No．22014年6月JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(E&T)Jun．2014文章编号：1006—9798(2014)02—0089—05；DOI：10．133061．1006—9798．2014．02．020黑松银松素合成酶的cDNA克隆及表达研究杨晓，宋修明，王艳士，李荣贵(1．青岛大学生命科学学院，山东青岛266071；2．青岛市森林病虫害防治工作站，山东青岛266000)摘要：松萎蔫病是由松材线虫引起的一种危害性极大的森林病害，为研究黑松对松材线虫的抗性机制，本文利用RT—PCR技术对黑松体内经

2、转录组分析获得的与银松素合成酶mRNA高相似度的序列进行扩增，获得了银松素合成酶cDNA，然后将此银松素合成酶基因(PSL)克隆到表达载体pET一15b上，构建了重组表达质粒pET一15b—PSL，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后构建工程菌，通过IPTG诱导，工程菌高效表达重组蛋白，经Ni2十螯合柱亲和层析得到了纯化重组银松素合成酶。该研究为了解黑松银松素合成酶的功能及松萎蔫病抗性松树的培育奠定了基础。关键词：黑松；银松素合成酶；cDNA；克隆；表达中图分类号：Q93—331；Q939．118文献标识码：A松萎蔫病是世界范围内的毁灭性森林疾病]。该病主要由松褐天牛(Mon

3、ochamusalternatusHope)携带松材线虫(Brsnzc“xylophilus)传播，不仅危害多种松科植物，而且造成严重的经济损失。近年来，对松萎蔫病的研究很多，WangZ等人_2]认为不同树种对松萎蔫病表现出不同抗性，这与松树的内源抗病物质密切相关。银松素合成酶(pinosylvinsynthase，PS)能够以肉桂酰辅酶A为底物合成银松素，是植物合成抗毒素的一个关键酶。所合成的银松素是松树最主要的内源杀线虫物质之一]，当植物受线虫入侵或损伤时，其将作为植物防御系统的重要组成部分而产生_4]。S．K．Sepp~nen等人l_5]研究表明，银松素合成酶的表达可以

4、增强植物对窄盖木层孔菌(Phellinustremulae)的抗性，提高抵御灰霉菌(Botrytiscinerea)侵染的能力，但目前日本黑松中的银松素合成酶的具体作用尚不清楚。本课题组前期对黑松进行了转录组分析，发现有一段与银松素合成酶高相似度的mRNA序列，因此，本文通过RT—PCR技术对银松素合成酶cDNA序列进行了克隆与表达，以期为进一步研究该基因的功能打下基础，也为松萎蔫病抗性树种的培育提供了理论依据。1材料与方法1．1菌株、质粒与试剂实验所用大肠杆菌E．coliDH5a、E．coliBI21(DE3)及pET一15b，购自美国Novagen公司；质粒pMD～18T

5、为宝生物工程(大连)有限公司产品；总RNA提取试剂盒、RT—PCR试剂盒及PCR扩增试剂为康维世纪公司产品。1．2黑松愈伤组织的培养将黑松种子放于50mI的小烧杯中，在流水下冲洗干净。将冲洗干净的黑松种子在超净工作台轻剥其外壳，置于事先用酒精擦拭过的空皿中，倒入适量的75乙醇溶液进行消毒处理，每次30S，共进行3次，接着用0．19／5的升汞溶液处理5rain，最后用无菌水冲洗6次。在超净工作台上剥除经消毒处理后黑松种子的收稿日期：2Ol3—12—31：修回日期：2014一O1一O5基金项目：国家自然科学基金项目(31070575)；青岛市科技发展计划项目(12—1—4—2一(

6、1)一jch，12一l一3—46一nsh)作者简介：杨晓(1989一)，女，硕士研究生，主要研究方向为病原微生物的检测与控制。通讯作者：李荣贵(1969一)，男，博士，教授，博士生导师。Email：lrg@qdu．edu．cn9O青岛大学学报(工程技术版)第29卷胚乳，然后选取完整的胚接种于诱导培养基上，置于恒温培养箱中黑暗培养8～l0d，诱导黑松愈伤组织的形成。选取细胞分裂快、结构疏松且未褐变的愈伤组织接种于继代培养基上进行传代培养[7。1．3引物设计与合成根据黑松转录组中银松素合成酶的mRNA序列，利用DNAman软件设计一对引物：引物1：5’一AAACATATGGGGG

7、GCGTTGATTTTGAAG一3’引物2：5’一AAACTCGAGCTAAAGAGGAACGCTCTTG一3’引物l和引物2分别含有NdeI和XhoI限制性酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1．4黑松愈伤组织总RNA的提取及RT—PCR将新鲜的未褐变的黑松愈伤组织置于预冷的研钵，经液氮充分研磨成粉状，按照康维世纪公司植物总RNA提取试剂盒说明书获得总RNA提取液，并通过琼脂糖凝胶电泳和吸光度测定判断提取获得的总RNA的质量和浓度。然后按照康为世纪公司RT—PCR试剂盒提供的操作流程