人幽门螺杆菌hspa亚单位的基因克隆及序列分析

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1、人幽门螺杆菌HspA亚单位的基因克隆及序列分析作者：吴升伟，吴升宇，苑天红，王明永，吴承龙【摘要】目的：获取幽门螺杆菌（Hp）热休克蛋白A（HspA）亚单位基因并进行核苷酸序列分析和同源性比较。方法：获取幽门螺杆菌的染色体DNA，PCR技术扩增获取HspA基因，将其定向插入pGEX-4T-1原核表达载体中进行核苷酸序列分析。结果：经酶切鉴定及基因序列证实HpHspA基因克隆成功，DNA序列与Genbank公布的序列比较有13个碱基存在差异，同源性为96%；由碱基序列推定编码的氨基酸残基序列没有发生变异，同源性为100%。结论：成功地将HpHspA基因克隆到了pGEX4T-1原核表达载

2、体，为HspA的表达和研究奠定了实验基础。【关键词】螺杆菌，幽门；HspA亚单位；克隆，生物；基因顺序［Abstract］Objective:TogetheatshockproteinA（HspA）subunitgeneofHelicobacterpylori,analyzeitsDNAsequence,andcompareitshomology.Methods:ChromosomeDNAofH.pyloriwasextractedandtheHspAgenewasamplifiedwithPolymeraseChainReaction（PCR）.TheobtainedDNAfrag

3、mentwas10clonedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX-4T-1andsequenced.Results:HspAgenewasclonedsuccessfullywhichwasdemonstratedbyenzymedigestingandgenesequencingmethods.ComparingwithDNAsequencesreportedinGenbank,nucleotidesequenceoftheobtainedDNAfragmentwas96%identicalwiththatofHspAgenewithavaria

4、tionof13basepairs.Thehomologyinputativeaminoacidswas100%.Conclusions:HspAgenehasbeenClonedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX4T-1successfully,whichmakesanexperimentalfoundationforitsexpressionandassociatedresearch.［Keywords］Helicobacterpylori；HspAsubunit；cloning,organism;geneorder幽门螺杆菌（Helicoba

5、cterpylori,Hp）是上消化道的重要致病菌之一，其感染与B型胃炎和消化性溃疡的发生密切相关，并被世界卫生组织列为胃癌发生的相关致病菌［1］。在Hp的免疫治疗研究方面，纯化的尿素酶（Ure）和热休克蛋白（Heatshock10protein，Hsp）及其亚单位成分均可作为抗原免疫动物刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用［2，3］，其中，以Hsp为抗原的疫苗可使70%～80%的试验小鼠获得保护［4］。Hp是一种微需氧的革兰阴性杆菌，体外生长时对外部环境及支持物的要求十分苛刻。目前通过细菌培养获得大量Hp，并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难。基因工程亚单位疫苗能克服这些不足，已

6、成为Hp疫苗研究的主攻方向，目前寻找高效抗原、适合载体及合理的免疫途径是疫苗研究的焦点。pGEX-4T-1原核表达载体是谷胱苷肽巯基转移酶（GST）融合表达系统，是一种极好的基因表达和纯化系统。pGEX-4T-1位于tac启动子上，能用化学方法诱导高效表达产生融合蛋白；基因表达时，表达产物是GST与目的基因的融合体，而载体多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。黄琛等［5］已将HpCagA蛋白肽段的基因克隆到pGEX表达载体，获得了很好的表达。目前尚未见将pGEX-4T-1载体引入到HpHspA亚单位疫苗研究中的报告。2003-2

7、004年运用PCR技术扩增人HpHspA基因，插入原核表达载体并对其进行基因序列分析和同源性比较，为处于探索阶段的HpHspA亚单位疫苗的研制提供一条选择途径。1材料与方法1.1菌株和质粒Hp，E.coilDH5a和原核表达载体pGEX-4T-1由曹承华硕士惠赠。1.2主要试剂10水解酪蛋白琼脂Mueller-HintonAgar购自杭州微生物试剂厂，两性霉素B、多黏菌素B、万古霉素购自华美生物公司，磺胺增效剂（TMP）购自贵阳制药二厂，TaqDNA聚合酶