结核分枝杆菌phos2基因的克隆及序列分析

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1、结核分枝杆菌phoS2基因的克隆及序列分析：丁淑琴,王洁,张焱,王淑静,朱佳佳,张怡清【摘要】目的扩增结核分枝杆菌phoS2基因，并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板，通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因，将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因，测序表明该片段开放阅读框为927bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为81%，推导编码氨基酸序列同源性为87%。结论成功克隆phoS2基因，为结核病原核表达及相关研究奠定了基础。

2、【关键词】结核分枝杆菌;phoS2基因;克隆;序列分析　结核病系结核分枝杆菌感染引起的慢性疾病,为国内外面临的严重的公共卫生问题[1]。结核病严重危害人类的生命健康,在当今世界上每1秒钟就有1人新感染结核病,如不控制，今后10年，全球将有9000万人发病[2]。快速、廉价、简单易用的诊断技术对于控制结核病发展和阻断其传播均有重要的意义。用免疫学方法检测结核病人血清中的特异性抗体是一种快速、简便的检查技术，在结核病的诊断中得到广泛的应用。寻找结核分枝杆菌特异性抗原是这项技术发展的关键，目前国内外研究人员主要采用基因工程的手段来获取单一特异抗原。phoS2(phos

3、phatetransportreceptors，即pstS3)是一种暴露于膜表面的磷酸盐转运受体,国内外曾有报道用phoS2裸抗原免疫小鼠后可以提高小鼠的抗结核感染能力[3-4]，但是尚未发现应用phoS2抗原诊断结核病的报道。本研究拟通过分子生物学技术获得结核分枝杆菌phoS2基因序列，并对其进行序列分析，为其进一步原核表达及用于血清学诊断的研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1质粒与菌种标准菌株H37RvDNA由西安第四军医大学王丽梅博士友情馈赠，pGEM-T连接载体购自Promega公司。　　1.1.2酶与试剂E.coliJM109感受

4、态购自北京全式金生物技术公司，X-gal、IPTG、TaqDNA聚合酶购自Promega公司，限制性内切酶EcoRI、XholI购自HIMERx公司，200bpDNAMarker、λDNAHindⅢMarker购自北京华美公司，质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生物工程公司。　　1.1.3PCR(聚合酶链反应)引物通过互联网GeneBank公共数据库检索出结核分枝杆菌phoS2基因序列(GeneID:885366)，分别在起始端和末端设计出一对引物。　　P1:5'-AGGAATTCATGACCCGCTTTGTCAACGTG-3'　　P2:5'-ATCTCG

5、AGTCAGGCGATCGCGTTGACCG-3'　　为了便于亚克隆，在引物1和引物2的两端分别引入了一个EcoRI和XholI酶切位点。引物由上海生物工程公司合成。　　1.2方法　　1.2.1PCR其反应组成为：10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,10mmoldNTP0.5μL,引物1和引物2各0.5μL，DNA2μL，TaqDNA酶0.5μL，ddH2O18.5μL。反应条件为：94℃4min;94℃30s,60℃30s，72℃30s，30个循环;72℃7min。待反应结束后，将PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳，观察结果。　　1.2.2PCR产物的

6、纯化与目的基因的克隆用DNA回收试剂盒对PCR产物切胶回收。DNA与pGEM-T载体在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产物转化入E.coliJM109感受态细胞，将其涂布于预先铺有(1M)IPTG和X-gal的YT平板上，37℃培养过夜。　　1.2.3重组质粒的酶切鉴定经蓝白斑筛选，挑选白色菌落，碱裂解法提取质粒，用EcoRI、XholI酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.2.4DNA序列测定及特性分析扩增片段重组质粒的序列由上海生物工程公司进行。将测序结果在NCBI/GeneBank数据库进行BLAST比较和分析。　　2结果　　2.1phoS2基因的

7、PCR扩增PCR成功扩增出特异性DNA片段，位于1000bp左右，与预期结果一致(见图1)。　　1.PCRproductsofphoS2;2.DNAMarker　　图1phoS2目的基因的扩增　　2.2phoS2/pGEM-T/JM109重组质粒的构建及鉴定PCR产物与pGEM-T载体连接，构建了扩增片段/pGEM-T/JM109重组克隆体系。经酶切鉴定，得到了大约1000bp的DNA片段(见图2)。　　1.phoS2/pGEM-TdigestedbyEcoRIandXholI;　　2.PCRproductsofPhoS2;3.phoS2/pGEM-Tplasm

8、id;　　4.pGEM-