imp-4基因的克隆、原核表达及活性测定

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1、IMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定【摘要】目的:采用RT-PCR法获取TIMP-4基因，并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法:从SD大鼠心肌组织中提取总RNA，利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因，经基因序列分析后构建表达载体PET-28a(+)-TIMP-4，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2+-NTA纯化和复性后，根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果:克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因，能在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的23.5%，N2+-NTA纯化和

2、复性后，纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论:通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。【关键词】TIMP-4基因克隆基因表达免疫活性Abstract:Objective:ToextractthegeneofTIMP-4withRT-PCRmethodsandobtainthebioactiveratTIMP-4fusionproteinexpressedinE.Coli.Methods:TotalRNAwasextractedfromcardiacmuscleofSDrat.

3、TIMP-4genewasobtainedandamplifiedwithRT-PCRmethod.Theisolatedfragmentwassequenced,recombinedwithplasmidpET-28a(+)atEcoRIandHindⅢsitesandtransformedintoE.colicells.Theexpressionof11TIMP-4wasinducedbyIPTG.TIMP-4proteinwaspurifiedandrenaturalizedbyN2+-NTA.Thecapabilityofinhibiting

4、migrationofosteosarcomacelllinewasusedasameasuretoassayitsviability.Results:TheTIMP-4geneoftherat,whichwasclonedandcorrectlycoded,couldbehighlyexpressedintheE.colistrain.TheexpressedproductoftheTIMP-4amountedfor23.5%ofthetotalbacterialprotein.TheTIMP-4amountedforatleast90%after

5、N2+-NTApurification.ThepurifiedTIMP-4proteincouldsignificantlyinhibitthemigrationofosteosarcomacellline.Conclusion:TIMP-4fusionproteinwithbioactivitycanbeobtainedprofuselybygenecloningandexpressioninE.Coli.Keywords:TIMP-4;geneclone;expression;viabilityassay目前对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有效的措施，

6、其主要原因在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性，对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。组织基质结构的破坏和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）为一类蛋白水解酶家族，它能降解多种胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等血管基膜和基质结构，为肿瘤的生长、转移创造合适的环境。金属蛋白酶组织抑制剂（tissue11inhibitorofmatrixmetalloproteinase，TIMP）的发现是肿瘤研究上的一大突破，它是MMP的天然抑制剂，目前根据发现的时间

7、顺序分别称为TIMP（1～4）。国内外对于TIMP-4的功能已经有了一些研究，但结果有所差异。Jiang等[1]的研究发现，TIMP-4可以抑制乳腺癌细胞的凋亡，而更多的实验表明TIMP-4为肿瘤生长的抑制因素[2，3]。为进一步开展对TIMP-4在骨肉瘤和软骨肉瘤方面的作用及其机制的研究，以及对其在其他领域的功能，本实验采用分子生物学的基因克隆、表达和纯化等手段，力求获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白，为以后的研究打下基础。1资料和方法1.1材料1.1.1组织来源：成熟SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供。1.1.2菌种、质粒和细胞：大肠杆菌

8、TG1、BL21(DE3)、pBluescriptSK(+)质粒、表达质粒pET-28a(+)均由第二军医大