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《结核分枝杆菌furb基因的克隆、表达和纯化论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化论文姜泓，薛莹，高雪，师长宏，柏银兰，张海，李元，徐志凯【关键词】结核分枝杆菌【Abstract】AIM:ToobtainMycobacteriumtuberculosis(MTB)furBfromH37RvDNA,expressefficientlyinE.coliandpurifytheFurBproteins.METHODS:furBplifiedbyPCRfromthegenomeofH37RvandclonedintopGEMTEasyvector.Afterse
2、quenced,furBedigestion,edpQE80LfurB.TheplasmidpQE80LfurBedintoE.coliDH5αandinducedbyIPTG.ThefurBexpressionedbyTB）在结核病(tuberculosis,TB)患者体内的生长与铁的利用有关.研究发现，MTB基因组包含了两个相似的铁摄取基因furA和furB.furA主要与其下游的katG基因表达有关,而furB的功能现在还不清楚．为此，我们在原核表达载体中表达MTBfurB并对其进行了纯化，为其功能研究奠定基
3、础.1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv,DH5α由本室保存;pGEMTEasy及TBH37Rv全基因组furB编码区(2641648N,2642040C)序列设计引物.上游引物P1:5′GGATCCAGTGCAGCCGGTGTCCGC3′中加入BamHⅠ酶切位点；下游引物P2:5′AAGCTTCCTTTTGGTGCTGGAGACGG3′中加入HindⅢ酶切位点.引物由上海博亚生物技术有限公司合成.1.2.2furB片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的MTBH37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2
4、~3L液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液（10×PCR绶冲液5μL,45g/L吐温5μL,45g/LNP405μL,20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL）中.于55℃水浴1h，沸水浴10min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μLTE中［1］,作为DNA模板.PCR反应体系为：10×buffer5μL,dNTPs5μL(2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL,P1,P2引物各1μL(25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL.PCR条件:94℃变性40s，56℃
5、复性30s，72℃延伸50s,25个循环.1.2.3PCR产物的克隆与鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带.取纯化的PCR产物与质粒pGEMTEasy进行连接反应，转化感受态DH5α,均匀涂布于含有xgal(33μL)和异丙基βD硫代半乳糖苷IPTG(20μL)的LB培养皿中，37℃培养16h,挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEMTEasyfurB，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定.1.2.4目的蛋白的诱导表达经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与经同样酶切的pQE80L载体进行连接反应
6、，转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE80LfurB.在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB培养基中过夜培养pQE80LfurB.按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3h，加入异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmoL/L，37℃继续培养4~5h.取1.5mL细菌培养物，8000g离心30s收集菌体，加入2×样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃,5min；8000g离心5min；取上清进行SDSPAGE电泳检测.1.2.5表达产物鉴定将经诱导的pQE80LfurB和E.coliDH5α分别制
7、样，进行TEasy载体，经测序证实所扩增的furB序列与Genbank数据库所收录的furB序列完全一致.2.2表达载体的构建pQE80L经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与furB目的片断进行连接反应后，转化感受态E.coliDH5α.挑取的克隆子进行酶切鉴定，切出约561bp大小片段的为阳性克隆子(Fig2)，命名为pQE80LfurB.2.3furB在pQE80L表达载体中的诱导表达将pQE80LfurB经37℃活化过夜，经IPTG诱导表达后做SDSPAGE分析，从电泳图中可以看出在Mr为15.0×103处出现
8、了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的20%(Fig3).2.4目的蛋白的鉴定所构建的重组质粒表达的FurB蛋白以带有6个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗(His)6mAb验证FurB蛋白的表达.结果显示在Mr为15.0×103处有一显色带，而对照无相应条带(Fig4).2.5表达蛋白的可溶性分析将上清和沉淀分别所制样品，进行SDSPAGE分析表明表达产物
