结核分枝杆菌rv2450c基因的克隆和原核表达论文

《结核分枝杆菌rv2450c基因的克隆和原核表达论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达论文李立青，苏明权，李立文，郝晓柯【关键词】分枝杆菌CloningandprokaryoticexpressionofMycobacteriumtuberculosisRv2450cgene【Abstract】AIM:ToexploretuberculosisRv2450cgenecanpromoteitsotuberculosiseDNAers,clonedintoBamHⅠandEcoRⅠsiteofpGEX4T2expressionvectorandconfirmedbysequencing.Af

2、tertherebinantexpressionvectorbeingtransformedintoE.coliBL21（DE3）,therebinantbacteriaplifiedonstratedthattheRv2450countedto22.9%oftotalbacteriaprotein．CONCLUSION:MycobacteriumtuberculosisRv2450cgeneissuccessfullyclonedandexpressedinE.coliBL21（DE3）.【Keytuberculosis;resuscitatio

3、npromotingfactor;cloning,molecular;geneexpression【摘要】目的：研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长.方法：培养结核分枝杆菌，提取其基因组，PCR扩增出Rv2450c基因，克隆入pSP73载体，测序分析.将该目的基因亚克隆入pGEX4T2表达载体.freelotingfactor,RPF）起了重要作用，但其具体机制还不清楚［1，2］.结核分枝杆菌H37Rv基因序列中Rv0867,Rv1009,Rv1884c,Rv2389c和Rv2450c基因均编码RPF样蛋白，它们同源性很高，是M

4、r约为16000的分泌蛋白.我们克隆表达了Rv2450c基因，为进一步研究其活性奠定了基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌TOP10，BL21（DE3）为第四军医大学西京医院检验科保存；原核表达载体pGEX4T2购自Pharmacia公司；质粒提取试剂盒购自Sigma公司；克隆载体pSP73、胶回收试剂盒购自Promega公司；BamHⅠ,EcoRⅠ等限制性内切酶和PyrobestDNA聚合酶、T4DNA连接酶、IPTG等购自Takara公司.1.2方法1.2.1PCR引物设计根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列（登录号：NC_

5、000962），设计引物，上游引物为5′GAAAGGATCCACGATGAAGAACGCCCGTAC3′，下游引物为5′TTTGAATTCTTTTGCGTCTTTTCGCGGTGGTCAG3′，在上、下游引物5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和3个保护碱基，以便于酶切和克隆，引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.2.2结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取刮取适量H37Rv菌落，TE（pH8.0）洗涤后重悬，加SDS至终浓度10g/L，蛋白酶K至终浓度0.1g/L,55～60℃水浴过夜，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、

6、氯仿：异戊醇（24∶1）各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇和1/10体积3mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1h沉淀DNA，用无水乙醇、700mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量ddH2O中.1.2.3Rv2450c基因扩增及克隆和鉴定以H37Rv基因组DNA为模板用PyrobestDNA聚合酶进行热启动PCR，循环参数为94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环后再72℃延伸10min.12g/L琼脂糖凝胶电泳观察分析扩增结果，切胶、用胶回收试剂盒纯化DNA，进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，用T4连接酶连

7、接，插入pSP73克隆载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，挑取生长状态良好的菌落接种含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基，次日提取质粒DNA，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，将获得的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，得到的正确重组质粒命名为pSP73Rv2450c.1.2.4Rv2450c基因原核表达载体的构建和鉴定将质粒pSP73Rv2450c用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，所获得的片断亚克隆到经同样双酶切的载体pGEX4T2中，得到的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），经氨苄青霉素筛选，阳性克隆送上海生工生

8、物工程有限公司进行测序，正确的重组质粒命名为pGEX4T2Rv2450c.1.2.5GSTRv2450c融合蛋白的诱导表达