浅论亚洲带绦虫膜联蛋白b2基因的表达、纯化及免疫学的论文

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1、浅论亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学的论文【摘要】目的对亚洲带绦虫膜联蛋白b2(annexinsb2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cdna文库中筛选出annexinsb2基因，并将该基因克隆到原核表达质粒pet-28a(+)中，在大肠埃希菌bl21/de3中诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定，重组后的蛋白用his-镍蛋白纯化柱纯化，纯化的重组蛋白用edasannexinsb2oftaeniasaginataasiticasoastoanalyzetheimmunogenicityof

2、itsrebinantprotein.methodsbyonlineanalysisofthegeneatbioinfomaticsthetaeniasaginataasiaticafull-lengthcdnaplasmidlibrary,thegeneedtoe.colibl21atography.inaddition,theimmunoreactivityofthepurifiedrebinantproteinsonstratedbypcr,doubleenzymedigestionanddnasequencingindicatedthattherebinantplasmid.c

3、onclusiontheannexinsb2oftaeniasaginataasiticahasbeenclonedandexpressedintheprokaryoticexpressionsystemandthepurifiedproteinhasbeenconfirmedmunogenicity.　　keymunoreactivity　　鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cdna质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。.本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白b2(annexinsb2)

4、的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pet-28a(+)及大肠埃希菌bl-21/de3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。　　1.1.2主要试剂和工具酶extaq酶(含dntp)，bamhⅰ，xhoⅰ，t4dna连接酶(大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-d半乳糖苷(iptg)(美国promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪igg二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(dab)显色

5、试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。　　1.2方法　　1.2.1annexinsb2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫annexinsb2基因进行blastx分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上bamhⅰ和xhoⅰ的酶切位点进行pcr反应。　　1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定pcr产物和pet-28a(+)载体分别用bamhⅰ和xhoⅰ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌bl-21/de3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和pcr鉴定，并进行重组质粒dna测序鉴

6、定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。　　1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的ni-idahis.bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用pbs24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。　　1.2.4plificationanddigestionesm1：dna标准(dl2000);1：pcr产物;2：pet-28a(+)质粒双酶切;3：pet-28a(+)-annexinsb2重组质粒双酶切;m2：dna标准(dl15000)。图2100g/ls

7、ds-page分析pet-28a(+)-taannexinsb2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物fig.2100g/lsds-pageanalysisoftheprokaryoticexpressionproductandpurifiedproduct　　m：蛋白marker;1：pet-28a(+)iptg未诱导;2：pet-28a(+)iptg诱导;3：pet-28a(+)-annexinsb2iptg未诱导;4：pet-28a(+)-