用cox1基因片段的pcr鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

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1、用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫：陈峥宏，郎书源，吴晓娟，包怀恩【摘要】目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法:用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物，对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定，并用NCBIBlast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果:5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物

2、PCR，均扩增出约260bp的产物，PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100％；2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物，而通用引物PCR则扩增出约1000bp的产物，核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99％，在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论:常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫；从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异，导致与特异性引物结合能力的差异

3、，可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。【关键词】线粒体cox1基因；绦虫属；聚合酶链反应　　［Abstract］Objective:TodistinguishTaeniaasiaticafromTaeniasaginatabycox1genefragmentsequenceamplifiederasechainreaction(PCR)method.Methods:Themitochondrialcox1genefragmentsofDuyunisolatesandCongjiangisolatesofTaenia

4、asiaticaandTaeniasaginataplifiedbyconventionalPCRusingspecificprimersandgeneralprimersanalysis.Thefragmentsedbyagaroseelectrophoresisandsequencinganalysis.ThesequencesentplifiedfromDNAspecimensof5DuyunisolatesofTaenia,efragmentplifiedfromDNAspecimensofCongjiangisolat

5、eseprimers.Thesequenceofthe260bpfragmenthada100%identityitochondrialcox1genereportedinNCBIdatabase.asterMix(TIANGEN)，DNAMarkerV（TIANGEN）。　　1.3PCR引物　　鼎安生化公司合成。亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物（Tasia：5′-ACGGTTGGATTAGATGTTAAGACTA-3′）、牛带绦虫cox1基因片段的特异性引物（Tsag：5′-TTGATTCCTTCGATGGCTTTTCT

6、TTTG-3′）及二者通用的反向引物（Rev：5′-GACATAACATAATGAAAATG-3′）均参考文献[1]合成。带绦虫cox1基因片段的通用引物：5′-TGGGTTTGTGGTCAGGTTTT-3′(coxF)和5′-TCCAATACGCAAGCAGACAA-3′（coxR），是以美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)数据库中带绦虫的cox1基因序列为模板，利用primer3网络引物设计软件设计，扩增产物为1020bp。　　1.4标本处理

7、　　用0.85％生理盐水洗虫体3次，取孕节剪碎，混悬于适量生理盐水中，0.106mm孔径不锈钢筛网过滤，将卵洗下，并用生理盐水洗涤3次备用。孕节碎片组织经生理盐水洗涤后备用。　　1.5DNA的提取　　采用DNA提取试剂盒，按说明书提取组织DNA的方法提取孕节碎片组织或虫卵的DNA，经紫外吸收法检测DNA含量。　　1.6cox1片段的扩增　　以200ng虫卵或孕节碎片组织的DNA为模板，采用2×TaqPCRMasterMix，分别用亚洲带绦虫和牛带绦虫的特异性引物及带绦虫通用引物，对都匀和从江带绦虫进行PCR扩增。扩增程序为：94

8、℃变性30s，60℃退火30s和72℃延伸90s，35个循环之后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。　　1.7PCR产物的核酸序列测定　　通过BigDyeTerminator方法，将3例都匀带绦虫的特异性引物PCR产物和1例从江带绦虫的通用引