亚洲带绦虫膜联蛋白b2基因的表达、纯化及免疫学分析

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1、亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析作者：白婧，李亚军，谢鹏，牟军【摘要】目的对亚洲带绕虫膜联蛋白B2(AnnexinsB2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出AnnexinsB2基因，并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化，纯化的重组蛋白用Westernblotting进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及重组质粒DNA

2、测序均显示重组体构建成功，并得到高纯度的蛋白，且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绕虫成虫AnnexinsB2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。【关键词】亚洲带绦虫;膜联蛋白B2;基因克隆;免疫反应性ABSTRACT:ObjectiveTocloneandexpressthegenenamedasAnnexinsB2ofTaeniasaginataasiticasoastoanalyzetheimmunogenicityofitsrecombinantonlineanalysisofthegeneat

3、bioinfomaticswebsitestoidentifythegenefromtheTaeniasaginataasiaticafull-lengthcDNAplasmidlibrary,thegenewasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET~28a(+)andthentransformedtoBL21withIPTGinduction.Thereafter,thegeneproductwasanalyzedbySDS-PAGEandpurifiedbyNi-NTAaffinitychromatogr

4、aphy.Inaddition,theimmunoreactivityofthepurifiedrecombinantproteinswasanalyzedbyWesterndemonstratedbyPCR，doubleenzymedigestionandDNAsequencingindicatedthattherecombinantplasmidwassuccessfullyconstructedandhighlyexpressed.TherecombinantproteintestedwithWesternblottinganalysiscoul

5、dreactwithTaeniaasiaticaandTaeniarhynchussaginatusinfectedpatientAnnexinsB2ofTaeniasaginataasiticahasbeenclonedandexpressedintheprokaryoticexpressionsystemandthepurifiedproteinhasbeenconfirmedwithimmunogenicity.KEYWORDS:Taeniasaginataasiatica;AnnexinsB2;genecloning;immunoreactiv

6、ity鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异［1-2］，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作［3］。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2（AnnexinsB2）的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。1材料与方法材料血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绕虫患者。原核表达质粒pET_28a（+）及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。主要试剂和工具酶ExTaq酶（含dNTP）,Ba

7、mHI,XhoI，T4DNA连接酶（大连宝生物工程公司）；异丙硫代-3-D半乳糖苷（IPTG）（美国Promega公司）；质粒纯化试剂盒（广州东盛科技公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3,3二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。方法B2基因的识别及扩增将获得的亚洲带緣虫AnnexinsB2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物（引物由上海联合基因公司合成），分别带上BamHI和XhoI的酶切位点进行PCR反应。重组原核

8、表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamH1和XhoI双酶切，回收