亚洲带绦虫膜联蛋白b2基因的表达、纯化及免疫学分析

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1、亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析：白婧，李亚军，谢鹏，牟军【摘要】目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(AnnexinsB2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出AnnexinsB2基因，并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化，纯化的重组蛋白用ethodsByonlineanalysisofthegeneatbioinfomaticstheTaeniasa

2、ginataasiaticafull-lengthcDNAplasmidlibrary,thegeneedtoE.coliBL21atography.Inaddition,theimmunoreactivityofthepurifiedrebinantproteinsonstratedbyPCR,doubleenzymedigestionandDNAsequencingindicatedthattherebinantplasmid.ConclusionTheAnnexinsB2ofTaeniasaginataasiticahasbeenclonedandexpressedinthe

3、prokaryoticexpressionsystemandthepurifiedproteinhasbeenconfirmedmunogenicity.　　KEYmunoreactivity　　鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2(AnnexinsB2)的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦

4、虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pET-28a(+)及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。　　1.1.2主要试剂和工具酶ExTaq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4DNA连接酶(大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。　　1.2方法　　1.2.1AnnexinsB2基因的识别及扩增将获得的

5、亚洲带绦虫AnnexinsB2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点进行PCR反应。　　1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和PCR鉴定，并进行重组质粒DNA测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。　　1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情

6、况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的Ni-IDAHis.Bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用PBS24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。　　1.2.4Westernblotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG进行Westernblotting鉴定。　　2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到E.coliBL/DE3中，超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2)，与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526

7、g/L。　　2.31：DNA标准(DL2000);1：PCR产物;2：pET-28a(+)质粒双酶切;3：pET-28a(+)-AnnexinsB2重组质粒双酶切;M2：DNA标准(DL15000)。图2100g/LSDS-PAGE分析pET-28a(+)-TaAnnexinsB2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物Fig.2100g/LSDS-PAGEanalysisoftheprokaryoticexpressionproductandpurifiedproduc