生后小鼠肾脏发育过程中ⅳ型胶原表达的实验研究

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1、生后小鼠肾脏发育过程中Ⅳ型胶原表达的实验研究【摘要】　　目的观察Ⅳ型胶原在生后小鼠肾脏发育过程中的表达规律，探讨Ⅳ型胶原在小鼠肾发育成熟过程中的作用。方法采用免疫组织化学方法检测生后不同日龄小鼠肾组织中Ⅳ型胶原的表达，用细胞图像分析技术和体视学方法对结果进行分析。结果Ⅳ型胶原表达于生后各日龄小鼠肾脏肾小体、肾小管和集合管的基膜，且随着肾脏的发育成熟，Ⅳ型胶原表达量逐渐增加。结论在生后肾发育成熟过程中，Ⅳ型胶原表达于基膜存在的部位，可能对基膜的发育成熟起一定的作用。【关键词】Ⅳ型胶原小鼠肾脏发育　　Abstract:Objectiv

2、eToobservetheexpressionofCollagenⅣinthedevelopingkidneyofneonatalmouseandstudyitsfunctioninrenaldevelopment.MethodsTheexpressionofCollagenⅣinneonatal（N）mousekidneysinedbyIHC,analyzedinacellimageanalyticalsystemandstereologicalmethod.ResultsTheexpressionofCollagenⅣcanb

3、eseeninthebasementmembraneofglomeruli,renaltubulesandcollectingducts.Bycellimageanalyticalsystemandstereologicalmethod,theexpressionofCollagenⅣainlyseeninthebasementmembraneduringrenaldevelopment.Itmayplayanimportantroleinthedevelopmentofbasementmembrane.　　Keyouse;kid

4、ney;development　　1引言　　Ⅳ型胶原与层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其它大分子交联成网格状结构，共同构成基膜［1］。Ⅳ型胶原是构成基膜的主要蛋白，占基膜干重50％，穿透整个基膜［2］。它通过受体integrin（整合素）和非integrin类的介导，与细胞之间发生粘附反应，直接或间接的控制细胞活动，如粘附或转移，分化和极化，增殖或凋亡及基因表达等，在基膜的形成和稳定中起非常重要的作用［3］。国内外学者对Ⅳ型胶原在肾组织中表达的研究显示，在肾脏发生发育过程中Ⅳ型胶原以一种复杂的动态方式表达于基膜［4］。本实

5、验应用免疫组织化学方法、细胞图像分析技术和体视学方法对生后小鼠肾发育过程中Ⅳ型胶原的表达及其含量变化进行了系统观察和定量分析，为进一步探讨Ⅳ型胶原在肾脏发育成熟过程中的规律及作用提供基本的实验依据。　　2实验材料和方法　　2.1实验动物　　昆明小鼠，体重25～30g，雌雄各半，供交配用，由辽宁医学院实验动物中心提供。　　2.2主要试剂　　Ⅳ型胶原多克隆抗体（SANTA公司提供）。　　SABC试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供）。　　DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供）。　　2.3实验方法　　2.3.1动物的培育　　选

6、用成年健康昆明小鼠，按雌雄比例1∶1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚0天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早8时、晚5时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0天。记录出生日期与母鼠同窝饲养。选取生后1天、3天、7天、14天、28天、40天的仔鼠，每组4只。　　2.3.2标本制备　　将生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后，于腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾脏切开，入10％中性福尔马林固定3h，流水冲洗半小时，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，对各组织块作厚为5μm的

7、连续切片，供免疫组织化学染色使用。　　2.3.3免疫组织化学染色　　切片常规脱蜡至水，3％H2O2消除内源性过氧化物酶活性，经pH6.0的枸橼酸盐缓冲液抗原热修复，滴加正常山羊血清封闭液、一抗（1∶100）过夜后，滴加生物素标记的二抗37℃孵育30min，滴加SABC37℃孵育30min后DAB显色，苏木素复染核，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。上述各部均用PBS缓冲液冲洗。用PBS代替一抗作阴性对照。阳性表达为肾小体、肾小管和集合管的基膜均呈不同程度的棕黄色。　　2.3.4免疫组织化学染色图像分析　　用CIAS-1000

8、细胞图像分析系统对生后各日龄小鼠肾脏免疫组织化学染色结果进行图像分析，以灰度值表示Ⅳ型胶原表达量，灰度值越大表示Ⅳ型胶原表达量越少，染色越浅。　　2.3.5体视学测量　　每组动物系统随机选取5个组织块，每个组织块连续切片后，等间隔选取5张切片，每张