钙结合蛋白D28k在小鼠肾脏发生发育中的表达

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1、中文摘要目的观察钙结合蛋白D28k(Calbindin．D28k)在小鼠肾脏发生发育中的表达规律及定位，探讨Calbindin．D28k在小鼠肾脏发生发育中的作用。方法选取体重25～309健康成年昆明小白鼠，采用检查阴道栓脱落的方法确定其受孕后，选取胚龄(E)10、12、14、16、18天的胎鼠和生后日龄(N)1、3、7、14、21、40天的仔鼠，每组取8只鼠。将各胚(日)龄小鼠剖腹取出肾脏，常规制作石蜡切片。应用光镜技术(IM)对不同发育阶段的小鼠肾脏进行观察；应用免疫组织化学(IHC)染色(SABC法)及免疫荧光技术(IFT)对各组小鼠肾脏Calbindin．D28k表达进行定性观察

2、；应用图像分析方法(CL峪一1000型细胞图像分析系统)对各组小鼠肾脏Calbindin．D28k表达进行定量检测；应用蛋白印迹技术(Westernblotting)对不同发育阶段小鼠肾脏Calbindin．D28k表达进行定量测定。结果I光镜结果：胚龄12天，输尿管芽出现，在输尿管芽周围围绕生后肾组织。胚龄14天，生肾区出现，即在输尿管芽分支周围出现了小泡体、逗号小体、S小体。胚龄16天，III、Ⅳ期肾小体出现。胚龄18天，早期髓质出现，其间散在大量间质，相当于成年后的髓质外带外区。生后1天，肾脏被膜下生肾区面积减少，可见肾乳头。生后7天，皮质生肾区消失，肾小体发育基本成熟，输尿管芽消

3、失，髓放线出现，可见近直小管，远直小管和集合管，肾乳头可见髓质外带内区。生后14天，皮质增厚，髓质可区分为髓质外带内外区。生后21天，皮质厚度明显增加，肾乳头内侧可见髓质内带，集合管数量增多。生后40天，肾及肾小体的发育达到成年水平，髓质外带以及内带清晰与成鼠完全相同。2免疫组织化学染色结果：胚龄10天，Calbindin．D28k在胎鼠肾脏中未见表达。胚龄12天，Calbindin．D28k在输尿管芽有所表达，表达强度比较微弱，生后肾组织未见表达。胚龄14天，Calbindin．D28k在输尿管芽分支表达增强，生肾区未见表达。胚龄16天，Calbindin．D28k在输尿管芽壶腹表达强

4、烈，肾小管和S小体未见表达，然而S小体与输尿管芽壶腹连接处表达。胚龄18天到生后3天，肾小囊、近端小管、髓袢未见表达，而远端肾单位表达增强。生后7天，Calbindin．D28k定位于肾脏的远曲小管、连接小管、皮质集合管。生后14天、21天、40天Calbindin．D28k在小鼠肾脏均有表达，其表达强度减弱且趋于稳定。Calbindin．D28k在小鼠肾脏的表达部位在细胞胞浆内。3C“峪．1000型细胞图像分析系统检测：肾脏发育不同时期Calbindin．D28k表达的灰度值有明显的差异：胚龄12天，Calbindin．D28k表达的灰度值最高，Calbindin．D28k有一定表达。

5、从胚龄12天到生后7天，Calbindin．D28k表达的灰度值降低，表达量逐渐增加，生后7天达高峰。从生后14天到生后40天，Calbindin．D28k表达量减少并趋于稳定，差异无显著性意义。4免疫荧光结果：Calbindin．D28k在胚龄10天胎鼠肾脏未见表达，胚龄12天在输尿管芽微量表达，胚龄14天在输尿管芽Y型分支表达，表达增强，胚龄16天在输尿管芽壶腹表达强烈，且在肾单位与输尿管芽壶腹连接部有少量表达。胚龄18天到生后7天，Calbindin．D28k表达逐渐增强，并定位于远曲小管、连接小管、皮质集合管。生后7天到生后40天，Calbindin．D28k在远曲小管、连接小管

6、、皮质集合管表达丰富，在髓质集合管表达下降。Calbindin．D28k表达部位在输尿管芽或远曲小管、连接小管、皮质集合管上皮细胞胞浆内。5Westernblotting结果：胚龄12天，Calbindin．D28k表达量极低，无法检测。胚龄14天到胚龄16天，Calbindin．D28k表达量增加，差异有显著性意义[(12．0994+0．6911)，(13．2383+0．1729)，P<0．01]。胚龄16天到胚龄18天，Calbindin．D28k表达量无显著性差异。胚龄18天到生后7天，Calbindin。D28k表达量明显增加，差异有显著性意义[(13．8447+0．2385)，

7、(15．2718±0．2019)，(16．3208_+0．2839)，(19．3383_+0．4044)，P<0．01]。生后7天到生后14天，Calbindin—D28k表达量减少，差异有显著性意义[(19．3383_+0．4044)，(15．891521．0185)，P<0．01]。生后14天到生后40天，Calbindin-D28k表达量无显著性差异。结论1．在小鼠肾脏发生发育中，Calbindin．D28k在胚龄12天胎鼠肾