脑缺血损伤大鼠海马区钙结合蛋白calbindind28k蛋白表达的变化及针刺对其影响

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1、脑缺血损伤大鼠海马区钙结合蛋白CalbindinD28k蛋白表达的变化及针刺对其影响作者：马惠芳任秀君林彩霞图娅【摘要】　　[目的]观察针刺对脑缺血损伤大鼠大脑海马区钙结合蛋白CalbindinD28k蛋白表达及神经行为学的影响。[方法]选用雄性SD大鼠，随机分为空白对照组、脑缺血模型组、针刺治疗组，每组10只，采用化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉手术复制大鼠局灶性脑缺血模型;针刺组采用针刺百会、水沟穴，每天1次，治疗7d;治疗结束后，采用免疫组化方法观察针刺前后大鼠海马区CalbindinD28k蛋白表达的变

2、化，造模后1～2h及治疗结束后分别对各组大鼠进行神经行为学评分。[结果]大鼠局灶性脑缺血后CalbindinD28k阳性细胞表达显著减少(与空白对照组比较，P<0.05)，针刺后大鼠大脑海马区CalbindinD28k阳性细胞表达显著增加(与脑缺血模型组比较，P<0.01)。大鼠在造模后1～2h的神经症状行为评分均有阳性反应，与空白对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)，针刺治疗组大鼠在治疗前后的神经症状行为评分差异也有显著性意义(P<0.01)。[结论]针刺可上调Calbindin

3、D28k蛋白的表达，减轻细胞内Ca2+超载，可能是针刺保护脑缺血损伤的机制之一。【关键词】脑缺血/针灸疗法脑组织/病理学疾病模型动物大鼠穴百会穴水沟　　在脑缺血损伤过程中，细胞内Ca2+超载是引起细胞凋亡的主要诱导因素之一，Ca2+通道阻滞剂等对动物缺血再灌注模型具有良好的脑保护作用[1]。有研究认为[2]局灶性脑缺血时钙结合蛋白CalbindinD28k在半影区表达上调可能是神经元自我保护机制之一，以缓冲及运输细胞内蓄积的Ca2+。电针对缺血性神经损伤具有保护效应，本文采用免疫组化法观察了CalbindinD

4、28k对局灶性脑缺血大鼠大脑神经元的保护作用及针刺对CalbindinD28k蛋白表达的影响，现报道如下。　　1材料与方法　　1.1实验动物与分组健康成年SD大鼠，清洁级，雄性，体质量(200±20)g，购于北京维通利华公司实验动物中心。许可证编号：SGXK(京)20022003。动物适应性喂养3d后随机分为空白对照组、脑缺血模型组、针刺治疗组，每组10只。　　1.2主要试剂与仪器CalbindinD28k免疫组化试剂盒由北京中杉试剂公司提供，产地美国;CMIAS2001A型多功能真彩色病理图像分析系统，由北京

5、煤炭总医院提供。　　1.3模型制作按Tamura等[3]的方法稍加改进。将大鼠用100mg/L水合氯醛(0.35mL/kg)腹腔麻醉后，左侧卧位，于眼眶后至耳的中点纵行切开皮肤约2cm，分离并切去部分颞肌，暴露颞骨，做一直径约3～5mm的骨窗，轻抬脑，可见到横过嗅束向上走行的大脑中动脉(MCA)，将浸有500mg/LFeCl3(用0.1mol/LHCl配置)溶液10μL的定量滤纸敷于暴露的MCA上20min。术区洒适量庆大霉素液，然后缝合皮肤，再于术口处局部使用青霉素粉少许消炎抗菌。　　1.4治疗方法空白对照组每天抓

6、取本组大鼠1次，不做其他处理。脑缺血模型组施以化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉手术复制局灶性脑缺血模型，每天于治疗组进行治疗时抓取本组大鼠，但不予任何治疗，7d后处死取材。针刺治疗组施以化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉手术，术后24h开始针刺百会、水沟穴，百会穴平刺2mm捻转1min，留针20min;水沟穴点刺1mm，捻转1min不留针，均每天1次，治疗7d后处死取材。　　1.5取材动物存活期满后，以100mg/L水合氯醛(0.35mL/kg)麻醉，迅速断头开颅取全脑置于体积分数10%甲醛液中固定1周。脑组织经常规步

7、骤处理，石蜡包埋，切片，片厚4μm，常温保存备用。　　1.6神经行为学评分于造模苏醒后(大约1h)和完成全部治疗处死前分别对各组大鼠进行神经症状行为评分。参照Bederson等[4]的方法并加以改进，对造模动物进行行为学评分。评分方法：①提鼠尾离开地面约30cm，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分;如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有肩肘的屈曲又有内旋者，记为l分。②将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力记为0分;如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。③将

8、动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分;手术对侧前肢肌张力下降者记为1分。④提鼠尾离开地面约30cm，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分。根据以上标准评分，1～4分为有效模型。满分为4分，分数越高，动物行为障碍越严重。　　1.7脑组织CalbindinD28k阳性细胞数检测采用免疫组化法检测。具体步骤如下