针刺对脑缺血再灌注模型大鼠海马 caspase3 mrna 表达的影响

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1、针刺对脑缺血再灌注模型大鼠海马caspase3mRNA表达的影响作者：冉群芳，倪光夏，项晓人【摘要】目的：探讨针刺对脑缺血再灌注大鼠脑组织保护作用的机制。方法：参考Bederson6级5分法进行神经功能评分和用原位杂交技术检测脑缺血再灌注24h后大鼠海马caspase3mRNA的表达。结果：穴位针刺组较非穴位针刺组和模型组更显著的改善大鼠缺损的神经功能(P＜0.05)。穴位针刺可以下调脑缺血再灌注大鼠海马caspase3mRNA的表达，与模型组、非穴组相比，差异有显著性(P＜0.01)。结论：针刺能够改善脑缺血

2、再灌注后大鼠的神经功能损伤，其作用机制可能是通过下调caspase3的表达，抑制凋亡实现的。【关键词】针刺;脑缺血;模型，动物;caspase3mRNA；原位杂交技术；大鼠；半胱氨酸蛋白酶类1材料和方法1.1实验动物选择及分组选用中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司提供的健康雄性成年SD大鼠50只，体重250±30g，随机分为正常组、假手术组、模型组、穴位针刺组、非穴位针刺组。1.2主要试剂及器械caspase3原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，多聚赖氨酸和DAB显色试剂盒购自福建迈新公司，LE

3、icaTP1020全自动组织处理仪，南京小松医疗仪器研究所生产的XS998B光电治疗仪，北航图像分析系统，华佗牌不锈钢毫针。1.3模型制备参照Longa(1989年)线栓法并加以改进：SD大鼠用10%水合氯醛(0.3mL/100g体重皮内注射)麻醉，仰卧固定。颈部正中切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，仔细分离避免损伤迷走神经。由颈外动脉远心端结扎颈外动脉，用微型动脉夹夹住颈总动脉近心端及颈内动脉，在靠近颈总动脉分叉处用眼科剪在颈外动脉上剪一小口，将直径0.26mm的尼龙钓丝涂有石蜡的一端沿小口插入

4、颈总动脉，剪断颈外动脉远心端，使颈外动脉和颈内动脉处于同一直线上，移去颈内动脉的动脉夹，经颈总动脉分叉处将鱼线缓慢向颈内动脉入颅脑内的方向推进约17-18mm，微遇阻力时停止，使鱼线头端到达较细的大脑中动脉起始处。缚紧预先放置于穿刺小口处的丝线，缝合，消毒，于缺血2h后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。假手术组大鼠只分离暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉。正常组不进行手术处理。再灌注2h后进行神经行为学评分，同时电针治疗。评分标准参考Bederson6级5分法：正常为5级(0分)；对侧上肢不能完全伸展为4级(

5、1分)；向对侧推时抵抗力下降为3级(2分)；提尾时向对侧转圈为2级(3分)；自动转圈为1级(4分)；无自发性活动、意识障碍为0级(5分)。神经行为学评分达到1-4分视为造模成功。1.4干预方法　　穴位针刺组取穴：根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，取内关(双侧)、人中、百会、风府。　　非穴位针刺组取穴：上述各穴向左侧平移0.5cm处，共5个点。　　针刺方法：在模型成功造成缺血再灌注后2h针刺1次。两组均留针20min，并通电针仪刺激，选用XS998B光电治疗仪，频率f2，刺激强度以保持针刺局部

6、轻微抖动为度。针具为“华佗牌”不锈钢针，0.35×25毫针。百会平刺，内关、风府直刺，深度均为0.5寸，人中直刺0.2寸。非穴位针刺组中百会左侧0.5cm处刺法同百会，内关、风府左侧0.5cm处刺法同内关、风府。人中左侧0.5cm处刺法同人中。1.5标本处理大鼠经再灌注24h后，用10%水合氯醛(0.3mL/100g体重皮内注射)腹腔注射麻醉大鼠，确定麻醉后大鼠仰卧位固定，用剪刀沿胸骨切一纵行切口，充分暴露心脏，于左心尖处剪一小口，用一支12号灌胃针从小口插入左心室到达主动脉处，并固定；将灌胃针和输液瓶接通，剪开右心

7、耳，滴注37℃温浴的生理盐水150mL，直至右心耳流出液变成清亮，再滴注4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含1‰DEPC)大约200mL固定。断头取脑，从嘴侧到尾侧冠状切片，切成5等份厚度的脑片，取尾侧的第2片放入4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中继续固定1h后，移入75%酒精脱水中止固定。标本入LEIcaTP1020全自动组织处理仪进行脱水、透明、浸蜡12h左右，然后石蜡包埋；镜下定位，确定海马部位后切片，片厚5μm。1.6原位杂交检测按照操作说明书操作：切片脱蜡至水后入3%的过氧化氢溶液中孵育10min，以消除内源性过氧化物

8、酶的活性。蒸馏水洗3次后胃蛋白酶消化10min。然后PBS洗3次蒸馏水洗1次，1%甲醛磷酸缓冲液固定10min。再蒸馏水洗3次后40℃恒温箱中预杂交3h，加杂交液，40℃恒温箱中过夜。用37℃SSC溶液杂交后洗涤，加封闭液37℃30min，生物素化鼠抗地高辛37℃60min，PBS洗涤4次，加SABC37℃20min，PBS洗涤3次，加生物素化