帕金森病小鼠相关脑区内钙结合蛋白d28k mrna的表达

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1、帕金森病小鼠相关脑区内钙结合蛋白D28kmRNA的表达　　摘要:目的研究钙结合蛋白D28k（CaBP）在帕金森病（PD）发病机制中的作用.方法将1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）按30mg・kg-1剂量腹腔注射给C57BL小鼠，建立PD鼠模型.用反转录PCR及原位分子杂交方法检测PD鼠和正常鼠脑内CaBPmRNA的表达变化.结果与正常鼠对比，CaBPmRNA在PD鼠的海马、纹状体、黑质等脑区的表达水平明显下调.结论CaBP可能通过对特定脑区神经元的保护作用来抵御PD的发生.　　Keyouse　　A

2、bstract:AIMTostudythepossibleroleofCalbindin-D28k（CaBP）inthepathogenesisofParkinson’sdisease（PD）.METHODS1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahy-dropyridine（MPTP）icetoestablishPDmicemodel.Reversetranscrip-tionPCRandinsituhybridizationRNAinthebrainofPDandcon-trolmice.RESULTSpa

3、redtocontrolmice，thereRNAlevelsinhippocampus，striatumandsubstantianigrainPDmice.CONCLUSIONCaBPmayplayaprotectiveroleforsomeneuronsagainstthepathogenesisprocessresponsibleforPD.　　0引言　　帕金森病（PD）的发病机制尚未清楚，有证据表明细胞毒性机制起着重要的作用.在一定的因素作用下，脑内一些区域的神经元受到毒性损害，使得其合成多巴胺的能力下降或丧失，导致PD症

4、状的产生.1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，可以诱导PD的产生，常用于PD动物模型的建立［1］.CaBP是相对分子质量为28×103的钙结合蛋白，可以结合细胞内的钙离子，使细胞免受钙离子过高而产生的毒性作用，因此具有细胞保护作用［2，3］.我们利用反转录PCR及原位杂交方法检测PD鼠脑内CaBPmRNA的表达变化，为探讨CaBP在PD发病机制中的作用提供依据.　　1材料和方法　　1.1动物模型的建立C57BL小鼠18只，体质量24～25g，实验前在安静环境中饲养至少24h以上.将小鼠随机分成两组

5、.实验组（10只）小鼠每日腹腔内注射30mg・kg-1MPTP，连续3d.对照组（8只）腹腔内注射等容量生理盐水.　　1.2反转录PCR部分实验组（4只）和对照组（4只）小鼠于麻醉下经心灌流0.01mol・L-1DEPC处理磷酸盐缓冲液后，快速取海马、纹状体及黑质，用Trizol试剂盒按常规方法提取总RNA，以oligo（dT）12～18及M-MLV反转录酶（Gibco）用反转录PCR法合成cDNA第一条链，置-30℃保存.CaBP引物由Takara公司合成，序列为:上游引物:5’-TGGATGATACG

6、AAACTTGGTG-3’，下游引物为:5’-GAACAGCTTCAGCATGAGGTC-3’，扩增片段大小为394bp.以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增.同时以β-actin引物进行扩增，作对照.扩增产物经30g・L-1琼脂糖凝胶电泳检测.　　1.3原位杂交另一部分小鼠于麻醉下，快速断头取脑，置于干冰粉末中.恒冷箱切片，片厚14μm，-70℃冰箱中保存备用.实验所用CaBP探针为含39个碱基的寡核苷酸探针，其序列与小鼠脑内CaBP的一部分（454～492号碱基）相互补［2］，探针用3’末端标记法及［α-35S］

7、dATP（Amersham）标记.其特异放射活性为30～50GBq・g-1.切片快速干燥后依次入40g・L-1多聚甲醛，0.1mol・L-1PB及杂交前处理液.杂交时将200～300μL杂交液（含500mL・L-1甲酰胺，0.25g・L-1tRNA，100g・L-1硫酸葡聚糖，10×Denhart’s液），15μLDTT及标记探针滴于切片表面，置湿盒中于40℃孵育48h.杂交后，用1×SSC冲洗（55℃，3×20min），最后将LM-1型乳胶（Ame

8、rsham）涂于切片表面，暗盒中曝光（4℃）.4RNA在各脑区的表达水平.利用Leica-500图像分析仪对各组小鼠各脑区内CaBPmRNA杂交信号的强度进行检测.对所得结果用t检验进行统计学分析.　　图1－图2略　　2.2原位杂交结