robo2调控小鼠肾脏和输尿管发育的研究

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1、南开大学博士学位论文Robo2调控小鼠肾脏和输尿管发育的研究姓名：季佳瑶申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：陈香美2012-05中文摘要Rob02调控小鼠肾脏和输尿管发育的研究背景：肾脏的发育是一个复杂过程，需要输尿管芽(UB)和后肾间充质(MM)两种细胞群精确的相互作用来完成的。某一环节出现错误会导致肾脏发育不良、膀胱输尿管反流等严重的肾脏和尿道发育异常。Rob02通过其配体Slit2在肾脏发育过程中发挥重要作用。Rob02／Slit2基因缺失可以导致调节肾脏发育的主要因素Gdnf的表达异常，从而使肾脏和输尿管发育异常，引起多个肾脏、多个输尿管和输尿管扩张改变。但是目前对于Ro

2、b02调控’肾脏和输尿管发育的研究仍比较缺少，主要是对肾脏发育初期Rob02／Slit2基因敲除导致输尿管芽萌出异常的研究，缺乏Rob02对肾脏发育后期的影响以及Rob02基因缺失导致肾脏和输尿管发育异常的机制研究。目的：通过观察和分析Rob02在肾脏发育过程中的表达变化、体外过表达Rob02对肾脏发育的影响、Rob02基因敲除对小鼠肾脏和输尿管发育的影响等现象，揭示Rob02在肾脏和输尿管发育过程中的作用及其机制。方法：(1)显微分离胚龄E12．5d、E13．5d、E14．5d、E15．5d、E16．5d、E17．5d、E18．5d胎鼠肾脏和生后日龄Pld、Plw、P4w小鼠肾脏，

3、石蜡切片进行PAS染色系统观察小鼠’肾脏发育各阶段的形态学变化特点；应用实时定量RT-PCR技术对肾脏组织中Rob02mRNA水平表达进行半相对定量分析；应用免疫荧光技术检N4,鼠肾脏发育过程中Rob02蛋白水平的表达部位。(2)显微分离胚龄E12．5d小鼠胚胎肾组织，应用显微注射及电转染方法，进行表达载体显微注射、转染。实验分为三组，正常对照组、空载体组、转染GFP—Rob02组。将体外转染的胚‘肾置于Transwell膜上，以气液交界面的方式培养3天后，进行肾小球和输尿管芽标志物(WTl、E．cadherin)和细胞增殖和凋中文摘要亡(PH3、TUNEL)免疫荧光染色，观察输尿管

4、芽分支、肾小球数目及后肾间充质细胞增殖、凋亡变化情况。(3)取野生型胚龄E13．5d和E14．5d小鼠胚胎输尿管膀胱组织，应用免疫荧光染色和实时定量RT-PCR的方法检测Rob02在输尿管、膀胱和中肾管(WD)的表达情况；应用组织PAS染色和免疫荧光染色的方法，观察Rob02基因敲除小鼠胚胎肾脏和输尿管发育异常的情况。(4)取野生型胚龄E12．5d小鼠胚胎肾脏、输尿管和膀胱组织，分别进行分离培养，分为正常培养组、去肾组、去膀胱组和去肾去膀胱组，共4组，每组1O个，于Transwell气液交界面上培养6天后，进行E．cadherin和0【．SMA免疫荧光染色，观察各组输尿管长度的变化情

5、况；并且应用显微注射和电转染的方法，对野生型E12．5d胚胎的膀胱三角区进行GFP．RNAiRob02质粒转染，体外培养6天后进行E．cadherin和0【．SMA免疫荧光染色，观察输尿管长度的变化情况。(5)取同窝E13．5dRob02基因敲除野生型和纯合子胚胎，冰冻包埋连续切片，TUNEL染色观察CND(commonnephricduct)凋亡情况。结果：(1)’肾脏发育过程中不同时间点的形态特征：①小鼠肾脏发育各阶段PAS染色结果显示，UB于E11．5d开始分支，E15．5d可见到初步形成的肾盂、肾盏；E16．5d有发育成熟的集合管、肾盂、肾盏；②MM在整个后肾发育阶段围绕UB

6、呈“帽”状分布；E13．5dLIB周围的MM聚集成团，可见逗号形体、S形体；E14．5d出现肾小囊腔；E15．5d出现发育成熟的肾小球；E16．5d可见发育成熟的肾单位(肾小球、近端小管、远端小管等)；出生后1．5d至1w肾小球数目继续增多；出生后2w肾脏发育成熟。(2)肾脏发育过程中Rob02的表达变化：①实时定量RT-PCR结果显示，Rob02在发育的E12．5d'-'E14．5d表达水平最高，随后水平明显下降，在出生后维持在低水平表达。②免疫荧光染色结果显示，Rob02最初表达在胚肾的后肾间充质，而不在输尿管芽表达。随着胚胎肾脏发育，Rob02表达于后肾间充质细胞膜、围绕输尿管

7、芽的浓缩帽状间充质、逗号形体和“S”形体以及毛细血管袢，最终表达于肾小球足细胞。另外，部分早期肾小管上皮细胞也有微弱Rob02表达。(3)过表达Rob02对肾脏发育的影响：①输尿管芽标志物E．cadherin和肾II中文摘要小球标志物WTl免疫荧光染色显示，正常对照组、转染空载体组肾脏输尿管芽分枝和肾小球数目无明显异常；而转染GFP．Rob02组的输尿管芽分枝减少，肾小球数目减少(p