atp7a调控小鼠神经元形态发育的机理研究

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1、分类号：１０３６４：单位代码：’密级：学号０４００：１２７２＾．签敏廖姓义旁学位论文ＡＴＦ７Ａ调控小鼠神经元形态发育的机理研究ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｕｌａｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＡＴＰ７Ａｉｎ化６ｎｅｕｒｏｎａｉｇ？■ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ？－研究生：超伟指导教师：王在帯副教授合诈指导教师：干度芳研究员．申请学位口类级别；巧学硕女专业名称：牛物化学与分子牛物学研究方向：分子细

2、胞生物学所在学院：牛命科学挙院答辩委员会主席：二〇—五年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进巧的研究工作及取得的研究。尽我所知成果，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论义中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。／研究生签名：ｆｅ时间：年＾月＾日終关于论文使用授权的说明本人完全了解安

3、徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可采用影印、缩印或扫描、汇编学位论文。意农业大学可用不同方式在不同媒体上等复制手段保存同安徽发表。、传播学位论文的全部或部分内容保密的学位论文在解密后应遵守此协议（）研究生签名４３：：屉时间年（＾日月输多一导师签：：名时年日第间月＾Ｊ７＾／户摘要铜是哺乳动物体内必不可少的微量元素之一，具有氧化还原化学性质，对机体的代谢过程有重要的作用。同时，铜作为含铜酶和含铜蛋白质

4、的重要组成部分，参与哺乳动物体内细胞呼吸、自由基清除、色素形成、结缔组织形成、神经肽加工和铁运输等。ATP7A是调节铜稳态的关键蛋白，还参与把铜传递给含铜酶和含铜蛋白，其基因突变导致的疾病，如门克斯病（MD），可以有效证明其作用的重要性。ATP7A功能的障碍往往伴随着神经退行，目前研究显示ATP7A受神经系统发育的时空调控，可能参与神经元的发育。为了研究ATP7A在神经元发育中的调控作用，本试验以C57BL/6小鼠为研究对象，分析了体外培养的小鼠神经干细胞（NSC）、星形胶质细胞和海马神经元中ATP7A

5、的表达水平。并且利用多功能诱导干细胞——小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）向神经元定向分化的方法，研究了MEF敲除Atp7a后向神经元分化的细胞形态学差异，结果如下：1.从C57BL/6小鼠胚胎和新生乳鼠中分别分离出了神经干细胞（NSC）、星形胶质细胞和海马神经元，并通过细胞免疫荧光染色对其进行鉴定，其纯度均达到90%以上。2.分离了E13.5-14.5小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），通过细胞免疫荧光染色分析了MEF和以上三种细胞中ATP7A的细胞定位，显示荧光信号均位于细胞核和质膜之间。3.通过real-ti

6、meQPCR和Westernblot比较了这四种细胞中ATP7A的mRNA及其表达水平，发现ATP7A在MEF、NSC、星形胶质细胞和海马神经元中表达量依次是显著减少的，说明ATP7A的表达随神经发育过程可能下降，并且证明利用MEF向神经元转分化研究ATP7A调控神经元发育的方案是可行的。4.利用分离到的基因型为Atp7afl/Y的胚胎成纤维细胞（MEF7a+），通过感染Cre重组腺病毒敲除Atp7a，获得MEF7a+·Cre+/-，并用real-timeQPCR和Westernblot验证了其敲除效率

7、约70%。5.进行重组腺病毒Ascl1,Brn2和Ngn2（ABN）诱导MEF7a+和MEF7a+·Cre+/-（ABN+MEF7a+和ABN+MEF7a+·Cre+/-），以及重组腺病毒Cre和ABN共同处理MEF7a+（ABNC+MEF7a+），向神经元的定向分化试验。分化7d和12d后，进行β-TubulinIII免疫荧光染色，对分化出的神经元进行形态上的分析和统计分析，计算胞体面积、神经纤维总长、最长神经纤维长度、从胞体发出的纤维数量、神经纤维分支数量。分化7d后，实验组与对照组细胞形态无明显差

8、别，阳性细胞胞体呈I圆形、椭圆形和三角形，大多从胞体伸出细长突起。统计分析发现分化7d时，ABN+MEF7a+·Cre+/-胞体体积较其他两组较小（*p<0.05），与对照组相比，其他两组中，细胞从胞体发出较少且较短的神经纤维（***p<0.001，**p<0.01），也具有较少分支（***p<0.001）；分化12d时，ABN+MEF7a+·Cre+/-和ABNC+MEF7a+胞体体积无差别，其他与分化7d时相似。综上所述，本试验从体外细