肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响

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1、肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响【摘要】观察肾康丸对体外高糖培养的大鼠系膜细胞（MC）增殖、细胞外基质分泌（ECM）和细胞周期的影响。【方法】将16只C分为5组：高糖模型组(30mmol/LGlu)，正常血清组(体积分数5%正常血清），开博通组（5%开博通血清）及肾康丸高、低剂量组（5%肾康丸高、低剂量血清），另设低糖（10mmol/LGlu）模型组。培养72h后，采用四甲基偶氮噬盐（MTT）法测定各组细胞增殖，双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测上清纤维连接蛋白（FN）含量，流式细胞仪检测细胞周期

2、。【结果】高糖培养的MC显著性增殖，上清FN含量显著性增加，并出现细胞周期异常，肾康丸能抑制MC增殖，减少FN分泌，并使Go/G期细胞比例显著性增加，而与期及G2/M期细胞比例减少。【结论】肾康丸可通过调整MC细胞周期异常，进而抑制高糖诱导的MC增殖和ECM分泌。【关键词】肾康丸药理学糖尿病肾病中药疗法细胞周期胞培养大鼠糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）全身性微血管并发症之一，也是导致DM患者死亡的重要原因。约40％的Ⅰ型DM和5％～10％的Ⅱ型DM患者可以发

3、生DN。DM可由多种途径损害肾脏，并累及肾脏的所有结构，从肾小球、肾血管直到肾小管和肾间质，随着病情的进一步发展，可影响肾功能不可逆转，最终导致终末期肾功能衰竭［1］。迄今为止，西医除强调控制血糖、血压外，对该病尚无特效药物。中药制剂肾康丸在临床用于治疗DN多年，具有确切的保护DM患者肾脏的作用［2-3］。肾小球系膜细胞（Mesangialcell，MC）的变化在肾脏疾病的发病中具有重要的作用［4］。为进一步探讨肾康丸治疗DN的作用机制，我们观察了肾康丸对体外高糖培养的MC增殖、纤维连接蛋白（Fibroin，FN）分泌和细胞周期的影

4、响，并与血管紧张素转换酶（Angiotensinconvertingenzyme，ACE）抑制剂开博通作对照。现报道如下：1材料与方法1.1动物和细胞株C细胞株，购于武汉大学。1.2受试药品和主要试剂肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、玉米须、水蛭等组成，南方医科大学珠江医院药剂科生产，批号：20031214；开博通片由上海中美施贵宝药业有限公司生产，批号：0402032。RPMI1640干粉为美国GIBCO公司产品；小牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚枫（DMSO）、碘化丙啶（PI）染液、L谷氨酰

5、胺和HEPES均为美国Sigma公司产品；丙酮酸钠为AMRESCO公司产品；RNA酶（Rnase）为上海生工产品；FN双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒由美国Diagnositca公司提供。1.3主要仪器CO2培养箱由广东新绿洲生物技术研究所生产；XD101型倒置显微镜由南京江南光电股份有限公司提供；Sodel∑960型酶标仪为MeterechInc公司产品；FACS20流式细胞仪为美国Bectondiskson公司产品。1.4药物血清制备16只大鼠随机分为4组：正常血清组，开博通组，肾康丸高、低剂量组。开博通组，肾康丸高、低

6、组分别按5mg/kg、2.4g/kg和1.2g/kg（按照人与大鼠体表面积换算，分别相当于成人37.5mg/d、24g/d、12g/d，即相当于成人临床用量的1倍、2倍和1倍）灌服相应药物混悬液，连续7d。正常血清组灌服等体积生理盐水。最后1次灌药（灌药前禁食不禁水12h）1h后，30g/L戊巴比妥（1.5mL/kg）腹腔麻醉，腹主动脉采血，3000r/min，离心10min，分离血清，56℃，30min水浴灭活，0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存。广州中医药大学学报2007年第24卷第6期肖炜，等.肾康丸对培养的大鼠系膜

7、细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响1.5MC的培养与分组MC加入含体积分数10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养液（含200μg/mL青、链霉素及2.38g/LHEPES），置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，取4～8代MC进行实验。每次实验前细胞经消化，1000r/min离心5min，DHanks液洗涤，然后重悬细胞（1×105/mL）并用含体积分数1%FCS的RPMI1640培养液培养24h，以使所有细胞同步化。同步化后，将MC分为5组：高糖模型组（体积分数1％FCS、30mmol/LGluRPMI

8、1640培养液），正常血清组（体积分数5％正常大鼠血清、体积分数1％FCS、30mmol/LGluRPMI1640培养液），开博通组（体积分数5％开搏通药物血清、体积分数1％FCS、30mmol/LGluRPMI1640培养液）及